用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的dna提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的DNA提取方法。在改良的CTAB法提取基因組DNA基礎(chǔ)上，把大量需檢測(cè)的不同株苦瓜嫩葉分別裝入1.5ml離心管內(nèi)，放入-80℃冰箱3h以上，后取出用洗凈的碾磨杵研磨5s左右，迅速加入2×CTAB提取緩沖液，再氯仿/異戊醇懸浮，異丙醇及70%乙醇洗滌沉淀，最后得到大量不同株待檢測(cè)樣品苦瓜基因組DNA。本方法解決了傳統(tǒng)的CTAB法提取苦瓜基因組DNA過(guò)于繁瑣的步驟，同時(shí)提取獲得的不同待檢測(cè)苦瓜基因組DNA濃度基本保持一致，且質(zhì)量及完整性完全適用于苦瓜雜交種純度的RAPD、SRAP及ISSR等分子鑒定。
【專利說(shuō)明】用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的DNA提取方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的DNA提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，有報(bào)道RAPD、SRAP及ISSR等分子標(biāo)記運(yùn)用于苦瓜雜交種純度分子鑒定，但由于分子鑒定苦瓜雜交種純度需要的個(gè)體樣本量大，而普通方法用液氮研磨嫩葉提取苦瓜D N A步驟過(guò)于繁瑣。因此，發(fā)展簡(jiǎn)便、快速可行的苦瓜D N A提取方法，以獲得理想的目的DNA用于分子鑒定就顯得極為重要。現(xiàn)有的一些常規(guī)D N A提取法雖經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)和簡(jiǎn)化，但步驟仍較多，而且大多需要液氮研磨后再轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)。當(dāng)然也有報(bào)道非常簡(jiǎn)便的方法提取玉米等一些植物DNA，但這些過(guò)于簡(jiǎn)便的方法無(wú)法獲得理想的苦瓜目的D N A，因此不能用于苦瓜雜交種RAPD、SRAP及ISSR等分子鑒定。
[0003]而本發(fā)明采用一種無(wú)需液氮研磨法提取苦瓜嫩葉DNA，極大地簡(jiǎn)化了苦瓜D N A的提取步驟，按此方法，每人一天內(nèi)即可完成約144個(gè)苦瓜樣品DNA提取。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的DNA提取方法，解決傳統(tǒng)的CTAB法提取苦瓜嫩葉DNA過(guò)于繁瑣的步驟(采用碾缽和液氮研磨每人一天一般只能提取48個(gè)左右樣品DNA)。本發(fā)明提供了一種利用改良的CTAB法提取苦瓜嫩葉基因組總DNA(每人一天可提約144個(gè)樣品)，該方法簡(jiǎn)便、適用性強(qiáng)，為苦瓜目的基因組總DNA進(jìn)行RAPD、SRAP及ISSR等純度鑒定打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
[0005]采用改良的CTAB法提取不同株雜交種苦瓜嫩葉基因組總DNA，但無(wú)需放入研缽內(nèi)用液氮研磨，放入-80°C冰箱3h以上，后取出用洗凈的碾磨杵研磨5s左右，迅速加入
2X CTAB提取緩沖液，再氯仿/異戊醇懸浮，異丙醇及70%乙醇洗滌沉淀，最后得到大量不同株待檢測(cè)樣品苦瓜基因組DNA。
[0006]本發(fā)明提供了一種提取苦瓜嫩葉總基因組總DNA理想方法，具體包括:
(1)在1.5 ml不同離心管內(nèi)放入待檢測(cè)的不同苦瓜嫩葉樣品DNA各0.1-0.3g，把裝有苦瓜嫩葉的離心管放在平板上，無(wú)需蓋管后直接放入_80°C冰箱冰凍3-5h ；
(2)依次從冰箱內(nèi)取出裝有苦瓜嫩葉的離心管，用洗凈擦干后的碾磨杵快速研磨5-7秒，加入500 μ?預(yù)熱至60°C的2XCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液，充分混勻；
(3)待所有樣品碾磨好及加完2XCTAB提取緩沖液后，一起放入65°C水浴12-25min,期間顛倒混勻I次，水浴后取出，在每管內(nèi)加等體積的氯仿異戊醇混合液，12000r/min離心 10 min ；
(4)取上清液300μ?至另一離心管，加等體積異丙醇和1/10體積的pH5.2、3 mo I/LNaAc (醋酸鈉),放置10 min,于4°C條件下12000 r/min離心5 min,白色沉淀DNA用濃度為70%乙醇洗滌一次后，于超凈臺(tái)風(fēng)干； (5)將風(fēng)干后的目的DNA溶解于50 μ?ΤΕ溶液，加入10 g/L、0.5 PLRNase，并于37°C溫育15 min ;即用于分子鑒定或于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0007]步驟(3)中氯仿異戊醇混合液中各組分體積比為24:1.該方法無(wú)需用碾缽加液氮研磨苦瓜嫩葉DNA，省略了用大量碾缽加液氮磨碎苦瓜嫩葉后再轉(zhuǎn)入離心管的繁瑣步驟，節(jié)省了大量時(shí)間。同時(shí)每管提取的苦瓜DNA濃度基本一致且質(zhì)量及完整性均較好，非常適合用于RAPD、SRAP及ISSR等分子標(biāo)記進(jìn)行大量苦瓜雜交種樣品純度的分子鑒定。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1:所獲得的不同樣品DNA用TaKaRa( Code:D520A)DNA Marker作為對(duì)照。從瓊脂糖凝膠電泳圖像示意圖1可知，所獲得的不同樣品目的DNA濃度基本一致，全都介于50ng-150ng之間，目的DNA純度及完整性較一般，但不影響下一步進(jìn)行RAPD、SRAP及ISSR等分子標(biāo)記進(jìn)行大量苦瓜雜交種樣品純度的分子鑒定。
[0009]圖2:上述方法提取的DNA應(yīng)用RAPD技術(shù)及引物CCTTGACGCA進(jìn)行新翠苦瓜雜交種純度鑒定，獲得一株具有母本特征條帶的假雜交種，該結(jié)果于田間種植純度檢測(cè)結(jié)果完全吻合，說(shuō)明此方法提取的DNA可用于新翠苦瓜雜交種純度鑒定；其中I表示I株具有母本特征條帶的假雜交種。
[0010]圖3:上述方法提取的DNA應(yīng)用SRAP技術(shù)及引物:TGAGTCCAAACCGGAAG;GACTGCGTACGAATTTGA進(jìn)行如玉5號(hào)苦瓜雜交種純度鑒定，獲得兩株具有母本特征條帶的假雜交種，該結(jié)果于田間種植純度檢測(cè)結(jié)果完全吻合，說(shuō)明此方法提取的DNA可用與如玉5號(hào)苦瓜雜交種純度的分子鑒定；其中I表示2株具有母本特征條帶的假雜交種。
[0011]圖4:上述方法提取的DNA應(yīng)用ISSR技術(shù)及引物:ACACACACACACACACCTG進(jìn)行如玉41號(hào)苦瓜雜交種純度鑒定，獲得兩株具有母本特征條帶的假雜交種，該結(jié)果于田間種植純度檢測(cè)結(jié)果完全吻合，說(shuō)明此方法提取的DNA可用于如玉41號(hào)苦瓜雜交種純度的分子鑒定，其中I表示2株具有母本特征條帶的假雜交種。

【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1
(1)在1.5 ml不同離心管內(nèi)放入待檢測(cè)的不同苦瓜嫩葉樣品DNA各0.2g，把裝有苦瓜嫩葉的離心管放在平板上，無(wú)需蓋管后直接放入_80°C冰箱冰凍3h ；
(2)依次從冰箱內(nèi)取出裝有苦瓜嫩葉的離心管，用洗凈擦干后的碾磨杵快速研磨5秒，加入500 μ?預(yù)熱至60°C的2 X CTAB提取緩沖液，充分混勻；
(3)待所有樣品碾磨好及加完2XCTAB提取緩沖液后，一起放入65°C水浴15min,期間顛倒混勻I次，水浴后取出，在每管內(nèi)加等體積的氯仿異戊醇混合液，12000r/min離心10min ；
(4)取上清液300μ L至另一離心管，加等體積異丙醇和1/10體積的pH5.2、3 mo I/LNaAc (醋酸鈉),放置10 min,于4°C條件下12000 r/min離心5 min,白色沉淀DNA用濃度為70%乙醇洗滌一次后，于超凈臺(tái)風(fēng)干；
(5)將風(fēng)干后的目的DNA溶解于50μ?ΤΕ溶液，加入10 g/L、0.5 PLRNase，并于37°C溫育15 min ;即用于分子鑒定或于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0013]實(shí)施例2:本發(fā)明方法提取得到的苦瓜DNA濃度及純度
所獲得的不同樣品DNA各取5μ?，同時(shí)取5μ? TaKaRa( Code:D520A)DNA Marker作為對(duì)照，用1%的Agarose,電壓約為10V/cm,電泳Ih左右后EB染色約5min,紫外燈下觀察后拍照。從電泳圖像示意圖1可知，所獲得的不同樣品目的DNA濃度基本一致，全都介于50ng-150ng之間，目的DNA純度及完整性較一般，但不影響下一步進(jìn)行RAPD、SRAP及ISSR等分子標(biāo)記進(jìn)行大量苦瓜雜交種樣品純度的分子鑒定。
[0014]實(shí)施例3:不同苦瓜雜交種純度的RAPD、SRAP及ISSR等分子鑒定結(jié)果
(1)上述方法提取的DNA應(yīng)用RAPD技術(shù)及引物CCTTGACGCA進(jìn)行新翠苦瓜雜交種純度鑒定，獲得一株具有母本特征條帶的假雜交種(見圖2)，該結(jié)果于田間種植純度檢測(cè)結(jié)果完全吻合，說(shuō)明此方法提取的DNA可用以新翠苦瓜雜交種純度的分子鑒定；
(2)上述方法提取的DNA應(yīng)用SRAP技術(shù)及引物:TGAGTCCAAACCGGAAG;GACTGCGTACGAATTTGA進(jìn)行如玉5號(hào)苦瓜雜交種純度鑒定，獲得兩株具有母本特征條帶的假雜交種(見圖3)，該結(jié)果于田間種植純度檢測(cè)結(jié)果完全吻合，說(shuō)明此方法提取的DNA可用以如玉5號(hào)苦瓜雜交種純度的分子鑒定；
(3)上述方法提取的DNA應(yīng)用ISSR技術(shù)及引物:ACACACACACACACACCTG進(jìn)行如玉41號(hào)苦瓜雜交種純度鑒定，獲得兩株具有母本特征條帶的假雜交種(見圖4)，該結(jié)果于田間種植純度檢測(cè)結(jié)果完全吻合，說(shuō)明此方法提取的DNA可用以如玉41號(hào)苦瓜雜交種純度的分子鑒定。
【權(quán)利要求】
1.用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的DNA提取方法，其特征在于:采用改良的CTAB法提取不同株雜交種苦瓜嫩葉基因組總DNA，但無(wú)需放入研缽內(nèi)用液氮研磨，放入-80°C冰箱3h以上，后取出用洗凈的碾磨杵研磨5s左右，迅速加入2 X CTAB提取緩沖液，再氯仿/異戊醇懸浮，異丙醇及70%乙醇洗滌沉淀，最后得到大量不同株待檢測(cè)樣品苦瓜基因組DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的DNA提取方法，其特征在于:所述方法具體包括以下: (1)在1.5 ml不同離心管內(nèi)分別放入待檢測(cè)的不同苦瓜嫩葉樣品各0.1-0.3g，把裝有苦瓜嫩葉的離心管放在平板上，無(wú)需蓋管后直接放入_80°C冰箱冰凍3-5h ； (2)依次從冰箱內(nèi)取出裝有苦瓜嫩葉的離心管，用洗凈擦干后的碾磨杵快速研磨5-7秒，加入500 μ?預(yù)熱至60°C的2 X CTAB提取緩沖液，充分混勻； (3)待所有樣品碾磨好及加完2XCTAB提取緩沖液后，一起放入65°C水浴12-25min,期間顛倒混勻I次，水浴后取出，在每管內(nèi)加等體積的氯仿異戊醇混合液，12000r/min離心 10 min ； (4)取上清液300μ?至另一離心管，加等體積異丙醇和1/10體積的pH5.2、3 mo I/LNaAc,放置10 min,于4°C條件下12000 r/min離心5 min,白色沉淀DNA用濃度為70%乙醇洗滌一次后，于超凈臺(tái)風(fēng)干； (5)將吹干后的目的DNA溶解于50μΙΤΕ溶液，加入10 g/L、0.5 PLRNase，并于37°C溫育15 min ;即用于分子鑒定或于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于苦瓜雜交種純度分子鑒定的DNA提取方法，其特征在于:步驟(3)中氯仿異戊醇混合液中各組分體積比為24:1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104371998SQ201410683660
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】張少平, 張玉燦, 鄭加協(xié), 鄭云云, 陳玉水, 林碧珍 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所