流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,包括以下步驟:種毒的制備、Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)、制苗病毒液的繁殖、病毒液的滅活及純化。本發(fā)明用細(xì)胞系代替雞胚組織培養(yǎng)制造禽流感病毒可解決雞胚自身及受外源病毒污染的問題,通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制,保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹,確保疫苗的安全性;本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn),具有自動化程度高,用人少,生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定;本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本,不會受制于原料供應(yīng),而且生產(chǎn)周期短;應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗,環(huán)境污染少且易于處理;而現(xiàn)有的雞胚生產(chǎn)法會產(chǎn)生的大量廢胚等廢物,且處理難度大,涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。
【專利說明】流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流感病毒疫苗領(lǐng)域,具體地,涉及一種流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的制備流感病毒疫苗的方法是使用雞胚制備的,國內(nèi)使用雞胚培養(yǎng)疫苗已經(jīng)有50多年的歷史。目前使用的流感疫苗主要是雞胚制備的滅活的流感三價(jià)裂解疫苗,包括甲型流感病毒株、H3N2和乙型流感病毒株以及大流感疫苗。病苗株的主要來源是由WHO根據(jù)每年全球流感病毒的變化規(guī)律推薦的用于下一年度流感疫苗生產(chǎn)用流感病毒流行株的表面抗原來決定的,將WHO推薦的流行野毒株與雞胚高產(chǎn)株雙重感染產(chǎn)生重配或反遺傳學(xué)重配,得到新的疫苗株,在雞胚上具有高產(chǎn)的特性,但雞胚存在有潛在污染的可能,以及潛在的雞胚蛋白引起的變態(tài)反應(yīng),而且培養(yǎng)周期過長,不易于控制產(chǎn)量。不利于用于應(yīng)對大規(guī)模的流感爆發(fā);該傳統(tǒng)工藝勞動強(qiáng)度大,耗時(shí)長、效率低,生產(chǎn)成本高;容易被環(huán)境污染;雞胚不同批次間的差異大;難以擴(kuò)大生產(chǎn);雞胚自身被細(xì)菌或其它病毒污染而致生產(chǎn)的疫苗存在質(zhì)量及安全隱患;生產(chǎn)疫苗后的廢胚數(shù)量多,無害化處理難度大,涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種的流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,以克服現(xiàn)有流感病毒疫苗的制備方法生產(chǎn)周期過長、所制備的疫苗存在安全隱患的問題。
[0004]本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是:流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,包括以下步驟:
1)種毒的制備
a)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):將Vero細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化傳代,在無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)Vero細(xì)胞使之形成單層細(xì)胞;
b)種毒的接種、繁殖:用細(xì)胞維持液,將來源WHO提供的H1或H3或B型流行毒株,稀釋10_4倍后接種在生長良好的上述單層細(xì)胞,同時(shí)加入l_3ug/L的Type IX胰酶,繼續(xù)培養(yǎng),至細(xì)胞50-100%以上病變時(shí)收獲病毒液;再將此病毒液作為種毒,在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代6代作為生產(chǎn)種子;
2)Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):取生長良好的Vero細(xì)胞,經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種在生物反應(yīng)器中;
3)制苗病毒液的繁殖:當(dāng)生物反應(yīng)器中的微載體上的Vero細(xì)胞基本長滿,且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)1 X 106/ml以上后將上述種毒接種在Vero細(xì)胞上,種毒接種后培養(yǎng)液中加入l_3ug/L的Type IX胰酶,種毒接毒量為0.0001-0.1M0I,每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體,用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況,并檢測上清液的HA效價(jià)和TCID50,待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落,且D0值呈明顯上升趨勢,停止反應(yīng)器攪拌,待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后,收獲上清液即為病毒液,所述為載體使用前需清洗、滅菌; 4)病毒液的滅活及純化:上述的病毒液滅活后進(jìn)行濃縮,再用用分子篩去除細(xì)胞來源的小的DNA及蛋白,使用離子交換柱去除細(xì)胞來源的DNA及其它帶有陰性電荷的細(xì)胞成分,病毒液再次進(jìn)行進(jìn)行濃縮獲得純化的病毒液。
[0005]進(jìn)一步地,微載體為plastic plus微載體。選用plastic plus微載體作為細(xì)胞生長的載體,該載體不含動物源的蛋白滿足生物安全的要求。
[0006]進(jìn)一步地,膜酶為Thermo scientific HyQTase -膜酶。Thermo scientificHyQTase -胰酶為植物來源的胰酶,避免了動物源性蛋白。
[0007]進(jìn)一步地,病毒液的濃縮采用750K Da MWCO中空纖維。750K Da MWCO中空纖維能夠高效快速的度病毒液進(jìn)行濃縮,且能夠避免引入不符合要求的蛋白源或是雜質(zhì)病毒。
[0008]一種流感病毒疫苗,所述流感病毒疫苗由流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法制備而成。
[0009]一種流感病毒疫苗的應(yīng)用,將流感病毒疫苗應(yīng)用到流感預(yù)防。
[0010]綜上,本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明用細(xì)胞系代替雞胚組織培養(yǎng)制造禽流感病毒可解決雞胚自身及受外源病毒污染的問題,通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制,保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹,確保疫苗的安全性。
[0011]2、本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本,不會受制于原料供應(yīng),而且生產(chǎn)周期短,每個(gè)生產(chǎn)周期僅需5-7天,相比現(xiàn)有雞胚培養(yǎng)法的15天以上大大縮短。
[0012]3、本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn),具有自動化程度高,用人少,生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定,易操作、產(chǎn)量大占用場地小,易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模,質(zhì)量易于實(shí)現(xiàn)均衡穩(wěn)定。
[0013]4、應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗,環(huán)境污染少且易于處理。而現(xiàn)有的雞胚生產(chǎn)法會產(chǎn)生的大量廢胚等廢物,且處理難度大,涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1是細(xì)胞法制備流感疫苗的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖,對發(fā)明作進(jìn)一步地的詳細(xì)說明,但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0016]實(shí)施例:
如圖1所示,流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,其特征在于,包括以下步驟:
I)種毒的制備
a)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):將Vero細(xì)胞經(jīng)Thermoscientific HyQTase -胰酶細(xì)胞分散液消化傳代,以HycloneSFiMMegaVir或相當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)液細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)形成單層細(xì)胞;
b)種毒的接種、繁殖:用細(xì)胞維持液,將來源WHO提供的當(dāng)年流行Hl,H3及B型流行毒株,稀釋10_4接種在生長良好的上述單層細(xì)胞,同時(shí)加入3ug/L的Type IX胰酶,繼續(xù)培養(yǎng),至細(xì)胞50-100%以上病變時(shí)收獲病毒液;再將此病毒液作為種毒,在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代6代作為生產(chǎn)種子; 2)Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):取生長良好的Vero細(xì)胞,經(jīng)Thermoscientific HyQTase -胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種反應(yīng)器中;
3)制苗病毒液的繁殖:生物反應(yīng)器中的微載體上的Vero細(xì)胞基本長滿,且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)IX 106/ml以上后將上述種毒接種在Vero細(xì)胞上,種毒接種后培養(yǎng)液中加入3ug/L的Type IX胰酶,種毒接毒量為0.0001-0.1M0I,每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體,用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況,并檢測上清液的HA效價(jià)和TCID50,待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落,且DO值呈明顯上升趨勢,停止反應(yīng)器攪拌,待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后,收獲上清液即為病毒液,所述為載體使用前需清洗、滅菌;
4)病毒液的滅活及純化:上述的病毒液首先用B-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活,用750KDa MWC0中空纖維對收獲也進(jìn)行濃縮,用分子篩如sepharose 4 fast flow去除細(xì)胞來源的小的DNA及蛋白,使用離子交換柱如Q sepharose XL virus licensed去除細(xì)胞來源的DNA及其它帶有陰性電荷的細(xì)胞成分,用750K Da MWC0中空纖維對病毒液進(jìn)行濃縮獲得純化的病毒液。
[0017]所述微載體為plastic plus微載體。
[0018]如上所述,可較好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1.流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,其特征在于,包括以下步驟: 1)種毒的制備 a)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)^fVero細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化傳代,在無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)Vero細(xì)胞使之形成單層細(xì)胞; b)種毒的接種、繁殖:用細(xì)胞維持液,將來源WHO提供的Hl或H3或B型流行毒株,稀釋10_4倍后接種在生長良好的上述單層細(xì)胞,同時(shí)加入l_3ug/L的Type IX胰酶,繼續(xù)培養(yǎng),至細(xì)胞50-100%以上病變時(shí)收獲病毒液;再將此病毒液作為種毒,在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代6代作為生產(chǎn)種子; 2)Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):取生長良好的Vero細(xì)胞,經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種在生物反應(yīng)器中; 3)制苗病毒液的繁殖:當(dāng)生物反應(yīng)器中的微載體上的Vero細(xì)胞基本長滿,且細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果達(dá)I X 106/ml以上后將上述種毒接種在Vero細(xì)胞上,種毒接種后培養(yǎng)液中加入l_3ug/L的Type IX胰酶,種毒接毒量為0.0001-0.1M0I,每隔一定時(shí)間取反應(yīng)器中微載體,用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況,并檢測上清液的HA效價(jià)和TCID50,待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落,且DO值呈明顯上升趨勢,停止反應(yīng)器攪拌,待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后,收獲上清液即為病毒液,所述為載體使用前需清洗、滅菌; 4)病毒液的滅活及純化:上述的病毒液滅活后進(jìn)行濃縮,再用用分子篩去除細(xì)胞來源的小的DNA及蛋白,使用離子交換柱去除細(xì)胞來源的DNA及其它帶有陰性電荷的細(xì)胞成分,病毒液再次進(jìn)行進(jìn)行濃縮獲得純化的病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,其特征在于,所述微載體為plastic plus 微載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,其特征在于,所述胰酶為Thermo scientific HyQTase -膜酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法,其特征在于,所述病毒液的濃縮采用750K Da MWCO中空纖維。
5.一種流感病毒疫苗,其特征在于,所述流感病毒疫苗由權(quán)利要求1所述的流感病毒疫苗的細(xì)胞生產(chǎn)方法制備而成。
6.一種流感病毒疫苗的應(yīng)用,其特征在于,如權(quán)利要求2所述的流感病毒疫苗應(yīng)用到流感預(yù)防。
【文檔編號】C12N7/04GK104436184SQ201410684948
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】高鵬, 左紅, 代榮濤, 楊秦 申請人:成都威爾諾生物科技有限公司