基于非標(biāo)記熒光染料和核酸適配體的檢測生物分子的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，旨在提供一種基于非標(biāo)記熒光染料和核酸適配體的檢測生物分子的方法。該方法是將核酸適配體和待檢測的生物分子混合后，加入與核酸適配體互補(bǔ)的寡核酸鏈；核酸適配體與待檢測的生物分子發(fā)生特異性結(jié)合，未結(jié)合的多余核酸適配體則與互補(bǔ)的寡核酸鏈雜交生成雙鏈DNA，而雙鏈DNA與非標(biāo)記熒光染料PicoGreen結(jié)合釋放熒光；不同濃度的待檢測的生物分子與固定濃度的核酸適配體結(jié)合時(shí)反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度不同，通過檢測熒光強(qiáng)度就能實(shí)現(xiàn)對生物分子快速、定量的檢測。本發(fā)明在提高檢測靈敏度和特異性的同時(shí)，縮短了檢測的時(shí)間，僅需25-40分鐘；對待檢測物質(zhì)的檢測靈敏度可以達(dá)到皮克-納克水平；本發(fā)明中使用的核酸適配體可以方便合成，成本低。
【專利說明】基于非標(biāo)記熒光染料和核酸適配體的檢測生物分子的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種基于非標(biāo)記突光染料PicoGreen和核酸 適配體檢測生物分子的快速檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 微生物、蛋白質(zhì)、多糖、多肽、毒素、化學(xué)藥物等生物分子的檢測依據(jù)檢測原理不同 可以分為：基于抗原_抗反應(yīng)技術(shù)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、基于核酸擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)技術(shù)的PCR和RT-PCR法、基于側(cè)向?qū)游黾夹g(shù)的膠體金法、基于儀器分析技術(shù)的質(zhì)譜、色譜 法等。除了儀器分析方法之外，其他各種方法雖然檢測方法快速，但是靈敏度和特異性低。 基于核酸擴(kuò)增的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的PCR和RT-PCR法雖然檢測靈敏度也高，但是對于非 微生物類樣品，無法進(jìn)行PCR或RT-PCR檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種基于非標(biāo)記熒光 染料和核酸適配體檢測生物分子的方法。
[0004] 為解決技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是：
[0005] 提供一種基于非標(biāo)記熒光染料和核酸適配體的檢測生物分子的方法，是利用非標(biāo) 記熒光染料PicoGreen能特異性結(jié)合雙鏈核苷酸且在結(jié)合后釋放熒光，而非標(biāo)記熒光染料PicoGreen與單鏈核苷酸不結(jié)合且游離的PicoGreen無突光的特性。將核酸適配體和待檢 測的生物分子混合后，加入與核酸適配體互補(bǔ)的寡核酸鏈；核酸適配體與待檢測的生物分 子發(fā)生特異性結(jié)合，未結(jié)合的多余核酸適配體則與互補(bǔ)的寡核酸鏈雜交生成雙鏈DNA，而雙 鏈DNA與非標(biāo)記熒光染料PicoGreen結(jié)合釋放熒光；不同濃度的待檢測的生物分子與固定 濃度的核酸適配體結(jié)合時(shí)反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度不同，通過檢測熒光強(qiáng)度就能實(shí)現(xiàn)對生物分 子快速、定量的檢測。
[0006] 本發(fā)明具體包括以下步驟：
[0007] (1)將核酸適配體分別與不同濃度的待檢測生物分子的標(biāo)準(zhǔn)品在微孔板的孔板內(nèi) 混勻；緩沖液為：10mm〇l/LTris，120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，20mmol/LCaCl2，pH8.5; 反應(yīng)5-10分鐘；反應(yīng)體系內(nèi)核酸適配體的濃度為0. 1?10納摩爾/升；
[0008] (2)加入與核酸適配體的序列互補(bǔ)的寡核酸鏈，反應(yīng)體系內(nèi)寡核酸鏈的濃度為 0. 1?10納摩爾/升；反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘；
[0009] (3)加入非標(biāo)記熒光染料PicoGreen;其在反應(yīng)體系內(nèi)濃度根據(jù)生產(chǎn)商的推薦值 確定；反應(yīng)15分鐘后，用酶標(biāo)儀或熒光分光光度計(jì)檢測非標(biāo)記熒光染料PicoGreen的熒光 強(qiáng)度，激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為520nm;
[0010] (4)根據(jù)待檢測生物分子的標(biāo)準(zhǔn)品濃度和非標(biāo)記熒光染料PicoGreen釋放的熒光 強(qiáng)度擬合曲線；
[0011] (5)以未知濃度的待檢樣品替換標(biāo)準(zhǔn)品，按照步驟（1)-(3)進(jìn)行操作，檢測非標(biāo)記 熒光染料PicoGreen釋放的熒光強(qiáng)度；然后根據(jù)步驟（4)擬合的標(biāo)準(zhǔn)品的曲線，計(jì)算待檢樣 品的濃度。
[0012] 本發(fā)明中，所述待檢測的生物分子是微生物、蛋白質(zhì)、多糖、多肽、毒素或化學(xué)藥物 中的任意一種。
[0013] 非標(biāo)記熒光染料PicoGreen是一種可以特異性與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，可以 檢測到皮克級的雙鏈DNA。單鏈的核酸不能結(jié)合PicoGreen，不產(chǎn)生熒光。
[0014]核酸適配體又稱適體（Aptamer)，是一條約20?100個(gè)核苷酸組成的單鏈、寡核苷 酸，最早于20世紀(jì)90年代由AndrewD.Ellington和JackW.Szostak通過"指數(shù)富集配體 系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)"體外篩選獲得。由于核酸適配體在范德華力、堿基堆積力等作用下折疊形成 特殊的三級結(jié)構(gòu)，因此可以和特定的生物分子結(jié)合。與傳統(tǒng)的抗體相比，寡核酸鏈具有制備 方便，易修飾，親和力高，穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，在生物傳感器、熒光檢測等方面得到廣泛應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明正是利用PicoGreen可以特異性結(jié)合皮克濃度的雙鏈DNA，而核酸適配體 是單鏈這一特性，設(shè)計(jì)了一種基于核酸適配體的、非熒光標(biāo)記的檢測生物分子的方法，檢測 下限可以達(dá)到皮克和納克水平。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0017] 本發(fā)明利用非標(biāo)記熒光染料PicoGreen和核酸適配體技術(shù)，開發(fā)了快速檢測技 術(shù)，在提高檢測靈敏度和特異性的同時(shí)，縮短了檢測的時(shí)間，僅需25-40分鐘。
[0018] 本發(fā)明對待檢測物質(zhì)的檢測靈敏度可以達(dá)到皮克-納克水平；本發(fā)明中使用的核 酸適配體可以方便合成，成本低。
[0019] 相對于【背景技術(shù)】，本發(fā)明具有高效、簡捷、快速、方便、適用廣等優(yōu)點(diǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 發(fā)明原理介紹：
[0021] 本發(fā)明通過在反應(yīng)體系中加入核酸適配體和待檢測的生物分子，然后再加入與核 酸適配體互補(bǔ)的寡核酸鏈。核酸適配體與待檢測的生物分子將發(fā)生特異性結(jié)合，而溶液中 多余的、未結(jié)合生物分子的核酸適配體可以與反應(yīng)體系中互補(bǔ)的寡核酸鏈雜交生成雙鏈 DNA。而雙鏈DNA又與PicoGreen結(jié)合，釋放熒光。不同濃度的待檢測的生物分子與固定濃 度的核酸適配體結(jié)合時(shí)，反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度不同，從而可以實(shí)現(xiàn)快速、定量檢測目的。
[0022] 本發(fā)明中，非標(biāo)記熒光染料PicoGreen通常使用商品化的產(chǎn)品，具體的反應(yīng)濃度 則依據(jù)生產(chǎn)商推薦使用濃度來確定，不同生產(chǎn)商推薦數(shù)據(jù)略有變化。
[0023] 以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任 何方式限制本發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例1 :毒素類的快速檢測
[0025] 以下程序以鍺曲毒素0TA和0TA適配體（序列5'-GCATCTGATCGGGTGTGGGTGGCGTA AAGG-3'）為例，闡述基于PicoGreen技術(shù)的快速檢測方法：
[0026] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
[0027] 取10微升10nmol/L0TA核酸適配體分別與10微升終濃度為0、0. 1、1、2、4、8、 10ng/mL的0TA溶液在96孔板內(nèi)混勻反應(yīng)。反應(yīng)緩沖液為：（10mmol/LTris，120mmol/L NaCl，5mmol/LKCl，20mmol/LCaCl2，pH8.5)，反應(yīng)體積 50 微升，反應(yīng)時(shí)間 5-10 分鐘。加入 10微升10nm〇l/L與OTA適配體互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸（序列為

【權(quán)利要求】
1. 基于非標(biāo)記熒光染料和核酸適配體的檢測生物分子的方法，其特征在于，是將核酸 適配體和待檢測的生物分子混合后，加入與核酸適配體互補(bǔ)的寡核酸鏈；核酸適配體與待 檢測的生物分子發(fā)生特異性結(jié)合，未結(jié)合的多余核酸適配體則與互補(bǔ)的寡核酸鏈雜交生成 雙鏈DNA，而雙鏈DNA與非標(biāo)記熒光染料PicoGreen結(jié)合釋放熒光；不同濃度的待檢測的生 物分子與固定濃度的核酸適配體結(jié)合時(shí)反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度不同，通過檢測熒光強(qiáng)度就能 實(shí)現(xiàn)對生物分子快速、定量的檢測。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟： (1) 將核酸適配體分別與不同濃度的待檢測生物分子的標(biāo)準(zhǔn)品在微孔板的孔板內(nèi)混 勻，緩沖液為：10mm〇l/L Tris，120mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，20mmol/L CaCl2, pH 8.5 ;反 應(yīng)體系內(nèi)核酸適配體的濃度為〇. 1?10納摩爾/升；反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘； (2) 加入與核酸適配體的序列互補(bǔ)的寡核酸鏈，反應(yīng)體系內(nèi)寡核酸鏈的濃度為0. 1? 10納摩爾/升；反應(yīng)時(shí)間為5-10分鐘； (3) 加入非標(biāo)記突光染料PicoGreen,其在反應(yīng)體系內(nèi)濃度根據(jù)生產(chǎn)商的推薦值確定； 反應(yīng)15分鐘后，用酶標(biāo)儀或熒光分光光度計(jì)檢測非標(biāo)記熒光染料PicoGreen的熒光強(qiáng)度， 激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為520nm ; (4) 根據(jù)待檢測生物分子的標(biāo)準(zhǔn)品濃度和非標(biāo)記熒光染料PicoGreen釋放的熒光強(qiáng)度 擬合曲線； (5) 以未知濃度的待檢樣品替換標(biāo)準(zhǔn)品，按照步驟（1)-(3)進(jìn)行操作，檢測非標(biāo)記熒光 染料PicoGreen釋放的熒光強(qiáng)度；然后根據(jù)步驟（4)擬合的標(biāo)準(zhǔn)品的曲線，計(jì)算待檢樣品的 濃度。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述待檢測的生物分子是微生物、蛋 白質(zhì)、多糖、多肽、毒素或化學(xué)藥物中的任意一種。
【文檔編號】C12Q1/04GK104458684SQ201410684970
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】宋厚輝, 金慶日, 楊夢華, 邵春艷, 程昌勇, 王曉杜, 楊楊, 楊永春, 衛(wèi)芳芳, 桂海孌, 張亞軍, 方維煥 申請人:浙江農(nóng)林大學(xué)