一種制備流感疫苗的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備流感疫苗的方法，包括以下步驟：種毒的制備、Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng)、制苗病毒液的繁殖、病毒液的滅活及純化。本發(fā)明用細(xì)胞系代替雞胚組織培養(yǎng)制造禽流感病毒可解決雞胚自身及受外源病毒污染的問題，通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制，保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性；本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，具有自動化程度高，用人少，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定；本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，不會受制于原料供應(yīng)，而且生產(chǎn)周期短；應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗，環(huán)境污染少且易于處理；而現(xiàn)有的雞胚生產(chǎn)法會產(chǎn)生的大量廢胚等廢物，且處理難度大，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。
【專利說明】_種制備流感疫苗的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及流感病毒疫苗領(lǐng)域，具體地，涉及一種制備流感疫苗的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的制備流感病毒疫苗的方法是使用雞胚制備的，國內(nèi)使用雞胚培養(yǎng)疫苗已經(jīng)有50多年的歷史。目前使用的流感疫苗主要是雞胚制備的滅活的流感三價裂解疫苗，包括甲型流感病毒株、H3N2和乙型流感病毒株以及大流感疫苗。病苗株的主要來源是由WHO根據(jù)每年全球流感病毒的變化規(guī)律推薦的用于下一年度流感疫苗生產(chǎn)用流感病毒流行株的表面抗原來決定的，將WHO推薦的流行野毒株與雞胚高產(chǎn)株雙重感染產(chǎn)生重配或反遺傳學(xué)重配，得到新的疫苗株，在雞胚上具有高產(chǎn)的特性，但雞胚存在有潛在污染的可能，以及潛在的雞胚蛋白引起的變態(tài)反應(yīng)，而且培養(yǎng)周期過長，不易于控制產(chǎn)量。不利于用于應(yīng)對大規(guī)模的流感爆發(fā)；該傳統(tǒng)工藝勞動強(qiáng)度大，耗時長、效率低，生產(chǎn)成本高；容易被環(huán)境污染；雞胚不同批次間的差異大；難以擴(kuò)大生產(chǎn)；雞胚自身被細(xì)菌或其它病毒污染而致生產(chǎn)的疫苗存在質(zhì)量及安全隱患；生產(chǎn)疫苗后的廢胚數(shù)量多，無害化處理難度大，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種制備流感疫苗的方法，以克服現(xiàn)有流感病毒疫苗的制備方法生產(chǎn)周期過長、所制備的疫苗存在安全隱患的問題。
[0004]本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是:一種制備流感疫苗的方法，包括以下步驟:
1)種毒的制備
a)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):將Vero細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，在無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)Vero細(xì)胞使之形成單層細(xì)胞；
b)種毒的接種、繁殖:用細(xì)胞維持液，將來源WHO提供的Hl或H3或B型流行毒株，稀釋10_4倍后接種在生長良好的上述單層細(xì)胞，同時加入l_3ug/L的Type IX胰酶，繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞50-100%以上病變時收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代6代作為生產(chǎn)種子；
2)Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):取生長良好的Vero細(xì)胞，經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后接種在生物反應(yīng)器中；
3)制苗病毒液的繁殖:當(dāng)生物反應(yīng)器中的微載體上的Vero細(xì)胞基本長滿，且細(xì)胞計數(shù)結(jié)果達(dá)I X 106/ml以上后將上述種毒接種在Vero細(xì)胞上，種毒接種后培養(yǎng)液中加入l_3ug/L的Type IX胰酶，種毒接毒量為0.0001-0.1MOI，每隔一定時間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測上清液的HA效價和TCID50，待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，收獲上清液即為病毒液，所述為載體使用前需清洗、滅菌； 4)病毒液的滅活及純化:上述的病毒液滅活后進(jìn)行濃縮，所得超濾液用KII連續(xù)離心機(jī)進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，得到超離液，對超離液進(jìn)行超濾透析去除蔗糖后進(jìn)行分子篩凝膠層析，獲得的病毒液通過超濾透析再度離心去除蛋白，收集上清液，然后過濾除菌、細(xì)胞碎片后，即得純化的病毒液。
[0005]進(jìn)一步地，微載體為plastic plus微載體。選用plastic plus微載體作為細(xì)胞生長的載體，該載體不含動物源的蛋白滿足生物安全的要求。
[0006]進(jìn)一步地，膜酶為Thermo scientific HyQTase -膜酶。Thermo scientificHyQTase -胰酶為植物來源的胰酶，避免了動物源性蛋白。
[0007]一種流感病毒疫苗，所述流感病毒疫苗由一種制備流感疫苗的方法制備而成。
[0008]—種流感病毒疫苗的應(yīng)用，將流感病毒疫苗應(yīng)用到流感預(yù)防。
[0009]綜上，本發(fā)明的有益效果是:
1、本發(fā)明用細(xì)胞系代替雞胚組織培養(yǎng)制造禽流感病毒可解決雞胚自身及受外源病毒污染的問題，通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴(yán)格控制，保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性。
[0010]2、本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，不會受制于原料供應(yīng)，而且生產(chǎn)周期短，每個生產(chǎn)周期僅需5-7天，相比現(xiàn)有雞胚培養(yǎng)法的15天以上大大縮短。
[0011]3、本發(fā)明應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行疫苗生產(chǎn)，具有自動化程度高，用人少，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定，易操作、產(chǎn)量大占用場地小，易于快速擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，質(zhì)量易于實現(xiàn)均衡穩(wěn)定。
[0012]4、應(yīng)用本方法生產(chǎn)疫苗，環(huán)境污染少且易于處理。而現(xiàn)有的雞胚生產(chǎn)法會產(chǎn)生的大量廢胚等廢物，且處理難度大，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是細(xì)胞法制備流感疫苗的工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例及附圖，對發(fā)明作進(jìn)一步地的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0015]實施例:
如圖1所示，一種制備流感疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟:
1)種毒的制備
a)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):將Vero細(xì)胞經(jīng)Thermoscientific HyQTase -胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，以HycloneSFM4MegaVir或相當(dāng)?shù)臒o血清培養(yǎng)液細(xì)胞生長液繼續(xù)培養(yǎng)形成單層細(xì)胞；
b)種毒的接種、繁殖:用細(xì)胞維持液，將來源WHO提供的當(dāng)年流行Hl，H3及B型流行毒株，稀釋10_4接種在生長良好的上述單層細(xì)胞，同時加入3ug/L的Type IX胰酶，繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞50-100%以上病變時收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代6代作為生產(chǎn)種子；
2)Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):取生長良好的Vero細(xì)胞，經(jīng)Thermoscientific HyQTase -胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后接種反應(yīng)器中； 3)制苗病毒液的繁殖:生物反應(yīng)器中的微載體上的Vero細(xì)胞基本長滿，且細(xì)胞計數(shù)結(jié)果達(dá)I X 106/ml以上后將上述種毒接種在Vero細(xì)胞上，種毒接種后培養(yǎng)液中加入3ug/L的Type IX胰酶，種毒接毒量為0.0001-0.1M0I，每隔一定時間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測上清液的HA效價和TCID50，待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，收獲上清液即為病毒液，所述為載體使用前需清洗、滅菌；
4)病毒液的滅活及純化:上述的病毒液滅活后進(jìn)行濃縮，所得超濾液用KII連續(xù)離心機(jī)進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，得到超離液，對超離液進(jìn)行超濾透析去除蔗糖后進(jìn)行分子篩凝膠層析，獲得的病毒液通過超濾透析再度離心去除蛋白，收集上清液，然后過濾除菌后，即得純化的病毒液。
[0016]所述微載體為plastic plus微載體。
[0017]如上所述，可較好的實現(xiàn)本發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1.一種制備流感疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)種毒的制備 a)細(xì)胞的傳代與培養(yǎng):將Vero細(xì)胞經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化傳代，在無血清培養(yǎng)液的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)Vero細(xì)胞使之形成單層細(xì)胞； b)種毒的接種、繁殖:用細(xì)胞維持液，將來源WHO提供的H1或H3或B型流行毒株，稀釋10_4倍后接種在生長良好的上述單層細(xì)胞，同時加入l_3ug/L的Type IX胰酶，繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞50-100%以上病變時收獲病毒液；再將此病毒液作為種毒，在細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞適應(yīng)性連續(xù)傳代6代作為生產(chǎn)種子； 2)Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的微載體懸浮培養(yǎng):取生長良好的Vero細(xì)胞，經(jīng)胰酶細(xì)胞分散液消化制備為細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后接種在生物反應(yīng)器中； 3)制苗病毒液的繁殖:當(dāng)生物反應(yīng)器中的微載體上的Vero細(xì)胞基本長滿，且細(xì)胞計數(shù)結(jié)果達(dá)1 X 106/ml以上后將上述種毒接種在Vero細(xì)胞上，種毒接種后培養(yǎng)液中加入l_3ug/L的Type IX胰酶，種毒接毒量為0.0001-0.1M0I，每隔一定時間取反應(yīng)器中微載體，用顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況，并檢測上清液的HA效價和TCID50，待觀察微載體上細(xì)胞基本全部脫落，且DO值呈明顯上升趨勢，停止反應(yīng)器攪拌，待微載體全部沉到反應(yīng)器底部后，收獲上清液即為病毒液，所述為載體使用前需清洗、滅菌； 4)病毒液的滅活及純化:上述的病毒液滅活后進(jìn)行濃縮，所得超濾液用KII連續(xù)離心機(jī)進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，得到超離液，對超離液進(jìn)行超濾透析去除蔗糖后進(jìn)行分子篩凝膠層析，獲得的病毒液通過超濾透析再度離心去除蛋白，收集上清液，然后過濾除菌后，即得純化的病毒液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備流感疫苗的方法，其特征在于，所述微載體為plastic plus 微載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種制備流感疫苗的方法，其特征在于，所述胰酶為Thermo scientific HyQTase -膜酶。
4.一種流感病毒疫苗，其特征在于，所述流感病毒疫苗由權(quán)利要求1所述的一種制備流感疫苗的方法制備而成。
5.一種流感病毒疫苗的應(yīng)用，其特征在于，如權(quán)利要求2所述的流感病毒疫苗應(yīng)用到流感預(yù)防。
【文檔編號】C12R1/93GK104436185SQ201410685181
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】高鵬, 符曉陽, 左紅, 代榮濤 申請人:成都威爾諾生物科技有限公司