用于治療補(bǔ)體-相關(guān)失調(diào)的適體治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了核酸治療及在補(bǔ)體-相關(guān)失調(diào)的治療中使用這些核酸治療的方法。
【專利說明】用于治療補(bǔ)體-相關(guān)失調(diào)的適體治療 本申請(qǐng)是2006年2月14日遞交的申請(qǐng)?zhí)枮?01310253256. 9,發(fā)明名稱為"用于治療 補(bǔ)體-相關(guān)失調(diào)的適體治療"的分案申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明通常涉及核酸的領(lǐng)域并且尤其涉及能夠結(jié)合補(bǔ)體系統(tǒng)的C5蛋白的適體，用于 補(bǔ)體-相關(guān)的心臟，炎癥，和自身免疫失調(diào)，缺血再灌注損傷和/或其它C5介導(dǎo)的補(bǔ)體活性 相關(guān)的疾病或失調(diào)的治療。本發(fā)明進(jìn)一步涉及能夠結(jié)合C5補(bǔ)體系統(tǒng)蛋白的適體給藥的材 料和方法。 技術(shù)背景 適體是通過經(jīng)典的Watson-Crick堿基對(duì)之外作用的具有與分子特異結(jié)合親合力的核 酸分子。 適體，正如通過噬菌體顯示或單克隆抗體（"Mabs"）產(chǎn)生的多肽，可以特異的結(jié)合選擇 靶標(biāo)和調(diào)控靶標(biāo)的活性，如，適體通過結(jié)合可以阻止其靶標(biāo)的功能。由源于任意序列寡核苷 酸集的體外選擇方法制備，已經(jīng)制備超過100種蛋白的適體，包括生長(zhǎng)因子，轉(zhuǎn)錄因子，酶， 免疫球蛋白，和受體。典型的適體是10_15kDa大小（30-45核酸），通過亞-納摩爾親合力結(jié) 合其靶標(biāo)，并且區(qū)分密切相關(guān)的靶標(biāo)（例如，適體將典型的不結(jié)合來源于相同基因家族的 其它蛋白）。一系列結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)說明了適體能夠使用在抗體-抗原復(fù)合物中產(chǎn)生親合力 和特異性的相同種類的結(jié)合作用（例如，氫鍵結(jié)合，靜電相互作用，疏水作用，空間排阻）。 適體具有許多的希望的用于治療和診斷的特征，包括高特異性和親合力，生物活性，和 良好的藥代動(dòng)力學(xué)特征。此外，他們提供優(yōu)于抗體和其它蛋白生物制劑的特異性競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)， 例如： 1) 速度和控制通過體外方法制備的適體，允許快速制備初始引導(dǎo)序列，包括治療引導(dǎo) 序列。體外選擇允許適體的特異性和親合力被嚴(yán)格地控制并允許制備引導(dǎo)序列，包括針對(duì) 毒性和非-免疫原靶標(biāo)的引導(dǎo)序列。 2) 毒件和免疫原件已經(jīng)證明適體作為一種類型具有極少或無毒件或免疫原件。在用 高劑量的適體（每天l〇mg/kg，連續(xù)90天）慢性給藥的大鼠或土撥鼠中，通過任何臨床，細(xì) 胞，或生化測(cè)定沒有發(fā)現(xiàn)毒性。盡管通過自身抗體的免疫反應(yīng)，許多單克隆抗體的功效能被 嚴(yán)格受限，但是引發(fā)針對(duì)適體的抗體是十分困難的，最可能是因?yàn)檫m體不能被由MHC介導(dǎo) 的T-細(xì)胞表達(dá)并且通常免疫反應(yīng)不識(shí)別核酸片斷。 3) 給藥盡管當(dāng)前大多數(shù)認(rèn)可抗體治療是通過靜脈注射給藥(典型地，大于2-4小 時(shí)），但是適體能通過皮下注射給藥（在猴體試驗(yàn)中通過皮下注射的適體生物活性> 80% (Tucker et al.，J. Chromatography Β·732:203_212，1999))。這種不同主要?dú)w因于較低溶 解性及由此大多數(shù)治療Mbs需要的大體積。具有良好的溶解性（> 150mg/mL)和較低分 子量（適體；10_15kDa;抗體：150kDa)，周劑量適體可以以小于0.5mL的體積注射。此外，小 尺寸的適體被允許滲透進(jìn)入構(gòu)象縊痕區(qū)域，而抗體或抗體片斷不被允許，表明了適體-基 礎(chǔ)治療或預(yù)防的另一優(yōu)勢(shì)。 4) 可量測(cè)件和成本治療適體是化學(xué)合成的從而ιΗ如需要，能容易地被量化以適合牛產(chǎn) 的要求。但是在量化生產(chǎn)中的困難目前限制了某些生物制劑的有效性并且大量蛋白產(chǎn)品制 備的資金成本是巨大的，單一的大量寡核苷酸合成器每年能生產(chǎn)IOOkg以上且需要相關(guān)合 適的起動(dòng)資金。目前在千克數(shù)量上適體合成的成本大約是$500/g，比得上高度優(yōu)化的抗體 的成本。在未來5年中，工藝發(fā)展上的繼續(xù)改善是希望將適體合成的成本降低至< $100/g。 5) 穩(wěn)定性治療適體具化學(xué)穩(wěn)定性。本質(zhì)上在暴露如加熱和變性劑的因素下之后他們適 合恢復(fù)活性并且以凍干粉的形式在室溫被儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)期（>1年）。 補(bǔ)體系統(tǒng) 補(bǔ)體系統(tǒng)包括在級(jí)聯(lián)調(diào)控系統(tǒng)中攻擊病原菌（如，細(xì)菌）細(xì)胞外形式的起作用的一組 至少20種漿和膜蛋白。補(bǔ)體系統(tǒng)包括兩種不同的酶激活級(jí)聯(lián)，經(jīng)典的和可選擇的路徑（圖 1)，和膜攻擊路徑的非-酶路徑。 第一種酶激活級(jí)聯(lián)，即經(jīng)典路徑，包括一些組合物，Cl，C4, C2, C3和C5(以路徑中的次 序排列）。通過免疫和非-免疫催化劑，隨著第一補(bǔ)體組合物（Cl)的結(jié)合和激活，補(bǔ)體系統(tǒng) 的經(jīng)典路徑開始出現(xiàn)。Cl包括Clq，Clr和Cls組合物的鈣-依賴性復(fù)合物，且通過Clq組 合物的結(jié)合被激活。Clq包括六個(gè)相同的亞單位并且每一亞單位包括三條鏈（A，B和C鏈）。 每一鏈具有一個(gè)球狀的頭部區(qū)域與膠原質(zhì)狀尾部連接。抗原-抗體復(fù)合物引發(fā)的Clq的結(jié) 合和激活發(fā)生在Clq的頭部區(qū)域。大量非抗體Clq催化劑，包括蛋白，脂質(zhì)和核酸，在膠原 質(zhì)狀的莖部區(qū)域的不同位點(diǎn)結(jié)合和激活Clq。Clqrs復(fù)合物隨即催化補(bǔ)體組合物C4和C2 的激活，形成作為C3轉(zhuǎn)化酶的C4bC2a復(fù)合物。 第二條酶聯(lián)激活，即可選擇的路徑，對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的激活和擴(kuò)大是一條快速的，抗體-依 賴的路徑。可選擇路徑包括一些組合物，C3,因子B，和因子D (在路徑的中以次序排列）。 當(dāng)C3b，C3的一種蛋白裂解形式，被綁定到一種催化表面試劑如細(xì)菌時(shí)，發(fā)生可選擇路徑的 激活。然后因子B被綁定到C3b，且由因子D裂解產(chǎn)生活性酶，Ba。然后酶Ba裂解更多C3 產(chǎn)生更多C3b，在催化表面產(chǎn)生C3b-Ba復(fù)合物的廣泛的沉積。 因此，經(jīng)典的和可選擇的補(bǔ)體路徑都產(chǎn)生分裂因子C3為C3a和C3b的C3轉(zhuǎn)化酶。與 此同時(shí)，兩種C3轉(zhuǎn)化酶進(jìn)一步裝配成C5轉(zhuǎn)化酶（C4b2a3b和C3b3Bb)。隨后這些復(fù)合物分 裂補(bǔ)體組合物C5形成兩種組合物：C5a多肽（9kDa)和C5b多肽（170kDa)。C5a多肽結(jié)合 7重跨膜G-蛋白偶聯(lián)受體，其起初與白細(xì)胞相關(guān)而現(xiàn)在認(rèn)為在各種組織，包括肝細(xì)胞和神 經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。C5a分子是人類補(bǔ)體系統(tǒng)的主要的趨化性組合物并且能夠引發(fā)各種生物反 應(yīng)，包括白細(xì)胞趨化性，平滑肌收縮，胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)換路徑的激活，嗜中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞 粘連，細(xì)胞因子和脂質(zhì)調(diào)節(jié)子的釋放和氧化劑的形成。 隨后，較大的C5b片斷結(jié)合補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的較大組合物，C6，C7，C8和C9以形成C5B-9膜攻 擊復(fù)合物（"MAC"）。C5b-9MAC能直接溶解紅細(xì)胞，并且在更大數(shù)量上，它是白細(xì)胞溶解酶 并且破壞如肌肉，上皮和內(nèi)皮細(xì)胞等組織。在亞溶破數(shù)量上，MAC能刺激粘附分子的上調(diào)作 用，并增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度和細(xì)胞因子釋放。此外，C5b-9MAC能刺激細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞和血小 板，而不引發(fā)細(xì)胞裂解。C5a和C5b-9MAC的非-裂解作用有時(shí)非常相似。 盡管補(bǔ)體系統(tǒng)在維持健康中起了重要的角色，但是它也具有引發(fā)疾病的潛能。例如，補(bǔ) 體系統(tǒng)的副作用涉及心臟冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)（"CABG")，眾多腎，風(fēng)濕性的，神經(jīng)的，皮膚病學(xué) 的，血液系統(tǒng)的，血管/肺部，敏感癥，感染和生物適應(yīng)性/休克的疾病和/或狀況，和糖尿 病視網(wǎng)膜病變。補(bǔ)體系統(tǒng)不是疾病的必要唯一原因，而是引發(fā)發(fā)病機(jī)理的多因子之一。 在Fitch et al.，Circ. 100 :2499-506(1999)中，測(cè)試了心臟冠狀動(dòng)脈旁路術(shù)體外循環(huán) ("CPB"）病人的抗-C5單鏈抗體片斷Pexeliz μ Mab的作用。在CPB之前，病人在十分鐘之 內(nèi)分別以〇· 5mg/kg，I. Omg/kg和2. Omg/kg施用單-丸劑量的Pexeliz μ Mab。在給藥前，給 藥5分鐘后，28°C 5分鐘后，在復(fù)溫開始后，在37°C下5分鐘后，和在CPB后7天，提取血液 樣本并測(cè)試補(bǔ)體的活性。藥效分析表明，補(bǔ)體溶血活性的抑制作用具有重要的劑量-依賴 性，在2mg/kg的劑量下大于14小時(shí)，并且促炎癥補(bǔ)體副產(chǎn)品（sC5b-9)的產(chǎn)生以劑量-依 賴性形式有效地被抑制。如上所述，但是，抗體治療具有一定的限制性。 因此，在補(bǔ)體-相關(guān)疾病治療的治療和診斷中，使用補(bǔ)體系統(tǒng)的新型抑制劑是有益的。 【專利附圖】

【附圖說明】 圖1是描述補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典和可選擇路徑的圖表。 圖2是來源于隨機(jī)序列寡核苷酸集落的體外適體選擇（SELEXtm)方法的示意性說明。 圖3A是描述抗-C5適體（序列號(hào)：1)的核酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖表，下劃線殘基可以 是2' -H嘧啶殘基或2' -氟嘧啶殘基，加框的殘基可以是2' -氟嘧啶殘基或2' -OMe嘧啶 殘基，由箭頭（一）表示的殘基代表包擴(kuò)2' -氟修飾的殘基。 圖3B是描述AR330抗-C5適體（序列號(hào)：2)的核酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖表，圓圈殘基 是2' -H殘基，嘧啶殘基是2' -氟替代，大多數(shù)嘌呤殘基是2' -OMe替代，此外三個(gè)2' -OH 嘌呤殘基突出顯示。 圖3C是描述述ARC186抗-C5適體（序列號(hào)：4)的核酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的圖表，所有 21個(gè)嘧啶殘基有2' -氟修飾且大多數(shù)嘌呤（14個(gè)殘基）有2' -OMe修飾，此外，三個(gè)2' -OH 嘌呤殘基突出顯示。 圖4是40kD的分支PEG(1，3-雙（mPEG-[20kDa])_丙基-2(4' - 丁酰胺）示意圖。 圖5是適體5'末端帶有40kD分支PEG(1，3-雙（mPEG-[20kDa])_丙基-2(4'- 丁酰 胺）的示意圖。 圖6是描述合成高分子量PEG-核酸共軛物的各種方法的示意圖。 圖7A是一張比較了 PEG化抗-C5適體（ARC657 (序列號(hào)：61)，ARC658 (序列號(hào)：62)和 ARC187(序列號(hào)：5))與非-PEG化抗-C5適體（ARC186(序列號(hào)：4))的溶血抑制的劑量依 賴性的圖表；圖7B是一張根據(jù)圖7A的描述，用于溶血分析的適體IC 5tl值的表格；圖7C是 一張比較了 PEG化抗-C5適體（ARC187(序列號(hào)：5)，ARC1537(序列號(hào)：65)和ARC1730(序 列號(hào)：66))和ARC1905(序列號(hào)：67)的溶血抑制的劑量依賴性的圖表；圖7D是一張根據(jù)圖 7C的描述，用于溶血分析的適體IC 5tl值的表格。 圖8是食蟹猴血清補(bǔ)體與人血清補(bǔ)體的，抗-C5適體，ARC658 (序列號(hào)：62)的溶血抑制 百分?jǐn)?shù)的圖表。 圖9是描述經(jīng)15分鐘孵育后，在37°C和室溫（23°C )下，ARC186(序列號(hào)：4)與純化的 C5蛋白結(jié)合的圖表。 圖10是描述經(jīng)4小時(shí)孵育后，在37°C和室溫（23°C )下，ARC186(序列號(hào)：4)與純化的 C5蛋白結(jié)合的另一圖表。 圖11是顯示在23°C下，C5 · ARC186復(fù)合物溶解時(shí)間的圖表。 圖12是顯示在23°C下，C5 · ARC186復(fù)合物形成平衡時(shí)間的圖表。 圖13是描述在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)上游和下游，ARC186(序列號(hào)：4)與C5蛋白或蛋白補(bǔ)體結(jié)合的 圖表。 圖14是描述在未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)者ARC186(序列號(hào)：4)，ARC657(序列號(hào)：61)，ARC658(序 列號(hào)：62)或ARC187(序列號(hào)：5)存在時(shí)，放射性標(biāo)記的ARC186(序列號(hào)：4)與C5結(jié)合的百 分?jǐn)?shù)。 圖15是描述在不同濃度的ARC186(序列號(hào)：4)適體存在時(shí)，在25°C和37°C下，孵育5 小時(shí)后，在血樣本中產(chǎn)生C5b補(bǔ)體蛋白數(shù)量的圖表。 圖16是描述在未稀釋的人血清，檸檬酸化的人全血或食蟹猴血清中的酵母聚糖存在 時(shí)，ARC187的（序列號(hào)：5)補(bǔ)體抑制百分?jǐn)?shù)圖表。 圖17是顯不在實(shí)施例ID描述的管環(huán)模型中，ARC658(序列號(hào)：62)對(duì)補(bǔ)體活性（C5a) 的完全抑制。 圖18是描述C5選擇集落Round 10分裂常數(shù)的圖表。通過將合適的數(shù)據(jù)填入等式：RNA 片斷結(jié)合=振幅XKd/(Kd+[C5])評(píng)估分裂常數(shù)（Kds)。"ARC520"（序列號(hào)：70)指天然的未 選擇的dRmY集落且" + "表示競(jìng)爭(zhēng)者的存在（0· lmg/ml tRNA，0. lmg/ml鮭魚精液DNA)。 圖19是描述C5克隆的分裂常數(shù)曲線的圖表。通過將合適的數(shù)據(jù)填入等式：RNA片斷 結(jié)合=振幅XKd/(Kd+[C5])評(píng)估分裂常數(shù)（Kds)。 圖20是描述對(duì)比ARC186(序列號(hào)：4)，不同濃度的抗-C5適體克隆ARC913(序列號(hào)： 75)對(duì)溶血活性抑制作用的IC5tl曲線的圖表。 圖21是描述ARC187(序列號(hào)：5)結(jié)構(gòu)的不意圖。 圖22是描述ARC1905序列號(hào)：67)結(jié)構(gòu)的示意圖。 圖23是描述第一個(gè)分離灌注心臟研究的試驗(yàn)設(shè)計(jì)的圖表。 圖24是暴露于人血漿（A)的分離心臟左心室（LV)心室內(nèi)壓力軌跡與暴露于對(duì)照適體 溶液⑶的分離心臟LVP壓力軌跡的比較圖。 圖25是暴露于等摩爾，IOX和50X適體/C5溶液（其中假設(shè)C5在正常，未稀釋的人 類血漿中的濃度大約為500nM)的分離心臟左心室（LV)心室內(nèi)壓力軌跡比較圖。 圖26是暴露于人血漿和各種血漿/適體溶液的分離的小鼠心臟間每分鐘心跳（bpm) 改變比較圖。 圖27是暴露于包括0-1 X摩爾比例ARC186 (序列號(hào)：4)(衰竭心臟），或10-50 X摩爾 比例（C5適體保護(hù)的心臟）的人血漿之前和之后的分離小鼠心臟重量改變比較圖。 圖28是灌注分離小鼠心臟后，含有不同適體濃度的人血漿中相關(guān)C5a產(chǎn)生的比較圖。 相對(duì)C5a濃度以吸收單位（Abs)作圖，其中高讀數(shù)反應(yīng)存在高C5a水平。 圖29是灌注分離小鼠心臟后，含有不同適體濃度的人血漿中相關(guān)可溶性C5b-9產(chǎn)生的 比較圖。 圖30是顯示在小鼠心臟流出物中ARC186(序列號(hào)：4)對(duì)C3分裂作用的圖表。 圖31是顯示分離灌注小鼠心臟研究中免疫組化染色結(jié)果表。 圖32是顯示人類或靈長(zhǎng)類血清中，保護(hù)心臟免受C5b-介導(dǎo)損害所需的ARC658 (序列 號(hào)：62)的摩爾比例表。 圖33是顯示大鼠和食蟹猴血漿中作為孵育時(shí)間函數(shù)的全長(zhǎng)ARC186剩余百分?jǐn)?shù)的對(duì) 數(shù)-線性圖。 圖34是顯示實(shí)施例5描述的Sprague-Dawley大鼠中藥代動(dòng)力學(xué)研究試驗(yàn)設(shè)計(jì)的表。 圖35顯不Sprague-Dawley大鼠中相對(duì)于時(shí)間的ARC657 (序列號(hào)：61), ARC658 (序列 號(hào)：62)或ARC187(序列號(hào)：5)的平均血漿濃度表。 圖36是描述在大鼠中靜脈施用適體后ARC657 (序列號(hào)：61)，ARC658 (序列號(hào)：62)或 ARC187(序列號(hào)：5)的平均血漿濃度圖。 圖37是顯示圖35和36描述的濃度相對(duì)于時(shí)間數(shù)據(jù)的非室分析表。 圖38A是顯示小鼠中ARC187(序列號(hào)：5)和ARC1905(序列號(hào)：67)藥代動(dòng)力學(xué)設(shè)計(jì)表； 圖38B是顯示⑶-1小鼠中ARC187(序列號(hào)：5)和ARC1905(序列號(hào)：67)靜脈內(nèi)推注給藥后 的藥代動(dòng)力學(xué)特征；圖38C是顯示圖38描述的濃度相對(duì)于時(shí)間數(shù)據(jù)的非室分析表。 圖39是顯示靜脈給藥后小鼠心臟中所列適體的測(cè)定表。 圖40是顯示實(shí)施例5E中描述的動(dòng)物研究1的試驗(yàn)設(shè)計(jì)表。 圖41是顯示食蟹猴靜脈推注給藥后適體血漿濃度相對(duì)于時(shí)間的表。 圖42是研究1中對(duì)食蟹猴靜脈內(nèi)施用ARC657 (序列號(hào)：61)，ARC658 (序列號(hào)：62)和 ARC187(序列號(hào)：5)后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)羅列表。 圖43(&)和43(〇)是描述對(duì)食蟹猴靜脈內(nèi)施用抗-05適體4此657(序列號(hào)：61)， ARC658(序列號(hào)：62)和ARC187(序列號(hào)：5)后的sC5b-9和C5a血漿濃度圖；圖43(b)和 43 (d)是描述sC5b-9和C5a血漿濃度相對(duì)于抗-C5適體ARC657 (序列號(hào)：61)，ARC658 (序 列號(hào)：62)和ARC187(序列號(hào)：5)濃度的圖。 圖44是顯示實(shí)施例5F描述的研究2的試驗(yàn)設(shè)計(jì)圖。 圖45是顯不對(duì)食蟹猴靜脈內(nèi)施用抗-C5適體ARC657 (序列號(hào)：61)，ARC658 (序列號(hào)： 62)和ARC187(序列號(hào)：5)后不同時(shí)間點(diǎn)的平均血漿適體濃度圖。 圖46是顯示對(duì)食蟹猴靜脈內(nèi)推注適體后對(duì)濃度相對(duì)于時(shí)間數(shù)據(jù)的兩室分析表。 圖47是存在酵母聚糖時(shí)食蟹猴血漿中C5b-9濃度相對(duì)于ARC187(序列號(hào)：5)或 ARC658(序列號(hào)：62)濃度描述圖。 圖48是存在酵母聚糖時(shí)食蟹猴血漿中C5a濃度相對(duì)于ARC187(序列號(hào)：5)或 ARC658(序列號(hào)：62)濃度描述圖。 圖49是概述食蟹猴靜脈內(nèi)推注加上灌注給藥期間和之后ARC187 (序列號(hào)：5) PK-H)研 究表。 圖50是概述食蟹猴靜脈內(nèi)推注ARC187(序列號(hào)：5)后藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)表。 圖51是描述食蟹猴靜脈內(nèi)推注加上灌注給藥期間和之后ARC187(序列號(hào)：5)藥代動(dòng) 力學(xué)特征的計(jì)算和實(shí)際測(cè)定值圖。 圖52描述食蟹猴靜脈內(nèi)推注加上灌注給藥期間和之后活性ARC187(序列號(hào)：5)血漿 剩余恒量水平圖。 圖53是顯示CABG手術(shù)所需抗-C5適體的人類劑量預(yù)測(cè)表。 圖54是通過凝血時(shí)間（PT)和活性部分凝血時(shí)間（APTT)測(cè)定ARC187(序列號(hào)：5)對(duì) 于凝結(jié)沒有體外效應(yīng)的顯示圖。 圖55是ARC187 (序列號(hào)：5)對(duì)于肝素抗-凝結(jié)活性，和魚精蛋白促凝活性體外效應(yīng)的 概述表。 圖56是ARC187(序列號(hào)：5)在體內(nèi)不影響肝素抗凝結(jié)逆轉(zhuǎn)的顯示圖。 圖57是通過測(cè)定對(duì)酵母聚糖補(bǔ)體活性的抑制，肝素和魚精蛋白不影響ARC187(序列 號(hào)：5)的抗-補(bǔ)體功能顯示圖。 圖58是作為抗-C5適體ARC187(序列號(hào)：5)或ARC658(序列號(hào)：62)濃度的函數(shù)，在存 在人血清時(shí)綿羊紅細(xì)胞溶血抑制百分率的顯示圖。 圖59A是在存在人類，食蟹猴和大鼠血清時(shí)ARC1905(序列號(hào)：67)對(duì)于溶血抑制百分 數(shù)的描述圖；圖59B是抗-C5適體ARC1905或不結(jié)合C5的非相關(guān)適體（陰性對(duì)照）對(duì)于人 類，食蟹猴和大鼠血清的補(bǔ)體活性抑制平均IC 5tl值的概述表。 圖60是在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中，作為未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)ARC1905 (序列號(hào)：67)或ARC672 (序列 號(hào)：63)(水平軸）的函數(shù)，放射標(biāo)記ARC186 (序列號(hào)：4)(垂直軸）抑制IC5tl值的顯示圖。 圖61是在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中，作為未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)ARC1905(序列號(hào)：67)(水平軸）的函 數(shù)，放射標(biāo)記ARC186(序列號(hào)：4)(垂直軸）在37°C和25°C抑制IC5tl值的顯示圖。 圖62是描述人類C5a(hC5a)和食蟹猴C5a(hC5a eq)標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示圖。 圖63是酵母聚糖-誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活試驗(yàn)中測(cè)定的，ARC1905 (序列號(hào)：67)在人類和食 蟹猴血清中抑制C5活性的IC5tl, IC9tl和IC99值的概述表。 圖64是酵母聚糖-誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活試驗(yàn)中測(cè)定的，作為人類和食蟹猴血清中 ARC1905(序列號(hào)：67)函數(shù)的C5a產(chǎn)生抑制百分?jǐn)?shù)的描述圖。 圖65是酵母聚糖-誘導(dǎo)的補(bǔ)體激活試驗(yàn)中測(cè)定的，ARC1905 (序列號(hào)：67)對(duì)于人類或 食蟹猴血清中C3a產(chǎn)生的效應(yīng)描述圖。 圖66是補(bǔ)體活性管環(huán)模型中測(cè)定的，5位自愿者中ARC1905抑制補(bǔ)體活性的IC5tl, IC9q 和IC99平均值概述表。 圖67在補(bǔ)體活性管環(huán)模型中，作為ARC1905, 一種抗-C5適體，或ARC127, 一種不結(jié)合 C非相關(guān)適體（陰性對(duì)照）的函數(shù)，C5a和C3a產(chǎn)生抑制百分?jǐn)?shù)的顯示圖。
【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明提供了治療，預(yù)防和改善補(bǔ)體相關(guān)疾病的材料和方法。在某一實(shí)施方案中，提供 了包括與PEG亞基共軛的ARC186(序列號(hào)：4)核酸序列的適體。在特定的實(shí)施方案中，這種 ARC186適體/PEG共軛物與由序列號(hào)：4組成但缺乏PEG亞基的適體具有與C5補(bǔ)體蛋白完 全相同的結(jié)合親合力。這里所述的完全相同的親合力指通過印跡雜交分析測(cè)得的分裂常數(shù) 差異不超過大約2-10倍，尤其不超過2-5倍。在某一實(shí)施方案中，正如實(shí)施例IA所述，分 裂常數(shù)由競(jìng)爭(zhēng)性印跡雜交分析測(cè)定。在某一實(shí)施方案中，聚乙二醇亞基的分子量大于10kD， 甚至有20kD，更甚至有30kD和40kD。在某一實(shí)施方案中，PEG亞基與ARC186(序列號(hào)：4) 的5'末端共軛。在某一實(shí)施方案中，通過實(shí)施例5E描述的方法測(cè)定的靈長(zhǎng)類中，適體/PEG 共軛物兩室模型的半衰期，尤其末端半衰期為至少15,尤其至少24小時(shí)，最合適地為至少 48小時(shí)。在某一實(shí)施方案中，在大鼠中，適體/PEG共軛物兩室模型的半衰期，尤其末端半衰 期為至少10,尤其至少15小時(shí)。在某一實(shí)施方案中，與ARC186(序列號(hào)：4) 5'末端共軛的 PEG是40kD的PEG。在特定的實(shí)施方案中，40kD PEG是分支PEG。在某一實(shí)施方案中，分支 的40kDPEG是l，3-雙（mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4'-丁酰胺）。在另一實(shí)施方案中，分 支的40kD PEG是2,3_雙（mPEG-[20kDa])_丙基-1-氨基甲酰。 在分支的40kDPEG是l，3-雙（mPEG-[20kDa])-丙基-2-(4'-丁酰胺）的實(shí)施方案 中，提供的適體結(jié)構(gòu)見下面所列：
【權(quán)利要求】
1. 一種適體或其鹽，其中適體的核酸序列為序列號(hào)：4。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適體/聚乙二醇（PEG)共軛物或其鹽，其中所述適體/PEG共 軛物的適體指的是權(quán)利要求1所述的適體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的適體/PEG共軛物或其鹽，其中聚乙二醇基團(tuán)的分子量為 10kDA、20kDA、30kDA或 40kDA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的適體/PEG共軛物或其鹽，其中聚乙二醇基團(tuán)包含40kDA的分 子量，并且所述40kDA聚乙二醇基團(tuán)是帶有支鏈的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的適體/PEG共軛物或其鹽，其中所述適體/PEG共軛物的序列 為：序列號(hào)：5、序列號(hào)：61、序列號(hào)：62、序列號(hào)：64、序列號(hào)：65或者序列號(hào)：67。
6. 權(quán)利要求1所述的適體或其鹽或權(quán)利要求2-5任意一項(xiàng)所述的適體/PEG共軛物或 其鹽在制備用于治療C5補(bǔ)體蛋白、C5a和/或C5b-9介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所治療的疾病是與CABG外科手術(shù)相關(guān)的心肌損 傷，與球囊血管成形術(shù)相關(guān)的心肌損傷、與再狹窄相關(guān)的心肌損傷、與CABG外科手術(shù)相關(guān) 的補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的并發(fā)癥、與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)相關(guān)的補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的并發(fā)癥、陣 發(fā)性血紅蛋白尿、急性移植排斥，超急性移植排斥，亞急性移植排斥或慢性移植排斥。
8. -種具有下述所示結(jié)構(gòu)的適體/聚乙二醇（PEG)共軛物或其鹽：
其中， .....表示C6烷基連接子 適體=fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfU mGfCmG-3T(SEQ ID NO：4), 其中fC和fU= 2'-氟核酸，并且mG和mA= 2'-0Me核酸而所有其它的核酸是2'-0H且3T表示反向的脫氧胸腺嘧啶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的適體/PEG共軛物或其鹽，其中所述適體/PEG共軛物或其鹽 具有下述所示的結(jié)構(gòu)：
其中適體=f CmGf Cf CGf CmGmGf Uf Cf Uf CmAmGmGf CGf Cf UmGmAmGf Uf Cf UmGmAmGf Uf Uf UAfC fCfUmGfCmG-3T(SEQ ID NO：4) 其中fC和fU= 2'-氟核酸，并且mG和mA= 2'-0Me核酸而所有其它的核酸是2'-0H且3T表示反向的脫氧胸腺嘧啶。
10. 權(quán)利要求8或9所述的適體/PEG共軛物或其鹽在制備用于治療C5補(bǔ)體蛋白，C5a 和/或C5b-9介導(dǎo)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其中所治療的疾病是與CABG外科手術(shù)相關(guān)的心肌損 傷，與球囊血管成形術(shù)相關(guān)的心肌損傷以及與再狹窄相關(guān)的心肌損傷、與CABG外科手術(shù)相 關(guān)的補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的并發(fā)癥、與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥、陣發(fā)性血紅蛋白 尿、急性移植排斥，超急性移植排斥，亞急性移植排斥或慢性移植排斥。
12. -種適體或其鹽，其中，所述適體包括序列號(hào)：75、76、95或者96的核酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的適體或其鹽，其中，所述適體在糖位點(diǎn)、磷酸位點(diǎn)或者堿基 位點(diǎn)包括一種化學(xué)取代物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的適體或其鹽，其中，所述適體包括修飾的核苷。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的適體或其鹽，其中所述適體進(jìn)一步包括3'封端。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的適體或其鹽，其中，所述適體與一種高分子量部分共軛。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的適體或其鹽，其中，所述高分子量部分是聚乙二醇基團(tuán)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的適體或其鹽，其中聚乙二醇基團(tuán)的大小是至少10、20、30、 40、50、60 或80KD。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的適體或其鹽，其中，所述聚乙二醇基團(tuán)是線性的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的適體或其鹽，其中，所述聚乙二醇基團(tuán)是帶有支鏈的。
21. -種組合物，包括權(quán)利要求12-20中任意一項(xiàng)所述的適體或其鹽、以及一種藥學(xué)上 可接受的載體或者稀釋劑。
22. 權(quán)利要求12-20中任意一項(xiàng)所述的適體或其鹽在制備用于治療C5補(bǔ)體蛋白、C5a 和/或C5b-9-介導(dǎo)的失調(diào)的藥物中的應(yīng)用。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其中治療的疾病是與CABG外科手術(shù)相關(guān)的心肌損 傷，與球囊血管成形術(shù)相關(guān)的心肌損傷、與再狹窄相關(guān)的心肌損傷、與CABG外科手術(shù)相關(guān) 的補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的并發(fā)癥、與經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)相關(guān)的補(bǔ)體蛋白介導(dǎo)的并發(fā)癥、陣 發(fā)性血紅蛋白尿、急性移植排斥，超急性移植排斥，亞急性移植排斥或慢性移植排斥。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK104404046SQ201410685384
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2005年2月14日
【發(fā)明者】克勞德·本尼蒂特, 大衛(wèi)·愛潑斯坦, 查爾斯·威爾遜, 迪拉爾·格拉特, 杰弗里·庫(kù)爾茲, 馬克斯·庫(kù)爾茲, 托馬斯·格瑞恩·卡尤利, 詹姆斯·羅特曼 申請(qǐng)人:阿切埃米克斯股份有限公司