一種與水稻株型和葉形性狀相關(guān)的蛋白pals1及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與水稻株高、分蘗數(shù)和葉形相關(guān)蛋白PALS1及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或者如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/插入且與水稻株型和葉形相關(guān)的由SEQIDNO:3衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從日本晴中分離克隆出 PALS1 基因，該基因?qū)儆贑HR4/MI-2-LIKE基因家族。將干擾基因表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化水稻，獲得的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)， PALS1 的表達(dá)量可以顯著影響水稻株高、分蘗數(shù)、葉寬和葉長，表明該基因在水稻株型和葉形分子育種中具有一定的應(yīng)用潛力。
【專利說明】-種與水稻株型和葉形性狀相關(guān)的蛋白PALS1及其編碼基 因與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一個位于水稻第7染色體長 臂上控制水稻株型和葉形的多效基因/^57 ArcAiieciare Zea/7)的 克隆及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在解決全人類食物安全上發(fā)揮著不可替代 的作用。在過去六十多年中，由于綠色革命和雜種優(yōu)勢的利用，水稻產(chǎn)量實現(xiàn)了兩次大飛 躍。但是，由于世界人口的持續(xù)增加，糧食安全始終是世界各國政府關(guān)心的頭等大事。所 以，培育良種、繼續(xù)提高單產(chǎn)就顯得尤為迫切，而理想株型育種被認(rèn)為是促成水稻產(chǎn)量第三 次飛躍的重要策略。理想株型是株高、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)等性狀的有機(jī)組合，促使水稻獲得最 大的生物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量。國際水稻研究所等研究機(jī)構(gòu)認(rèn)為水稻理想株型具有植株高度適 中、分蘗少、穗粒數(shù)多、莖桿粗壯等特征。
[0003] 株高是重要的農(nóng)藝性狀，也是影響水稻株型的重要因子之一。上世紀(jì)60年代廣 泛推廣的矮化品種大幅提高了產(chǎn)量，被稱為是水稻的"第一次綠色革命"。隨著水稻綠色革 命基因被克隆，近年來發(fā)現(xiàn)了大量參與株高的調(diào)控基因，涉及到赤霉素、油菜素內(nèi)酯、 細(xì)胞分裂素、生長素的合成和降解途徑（Sasaki et al·，2002; Zhou et al·，2013)。單 株分蘗數(shù)也是水稻產(chǎn)量構(gòu)成的重要因素之一，穗數(shù)的多少在很大程度上取決于分蘗數(shù)的多 少。在控制水稻分蘗基因的克隆方面，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的數(shù)量性狀位點(diǎn)，大部分是初步 定位，只有少部分被克隆?；虻目寺∈撬痉痔Y機(jī)理研究領(lǐng)域取得的最重要進(jìn)展之 一（Li et al.，2003)。葉片作為光合作用的主要器官，在水稻產(chǎn)量形成中發(fā)揮著關(guān)鍵性作 用。適當(dāng)?shù)娜~面積可以形成良好的光合群體，為實現(xiàn)水稻高產(chǎn)提供能量。因此，水稻葉形改 良也是株型改良的重要目標(biāo)。
[0004] 現(xiàn)有研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，水稻株高與分蘗數(shù)存在一定的相關(guān)性，調(diào)控這兩個性狀的很 多基因存在于相同的信號通路上，而關(guān)于株高、分蘗數(shù)和葉形三者相互關(guān)系的研究還未見 報道。因此，本領(lǐng)域有必要尋找同時控制這三種性狀的基因，探尋相互間的調(diào)控機(jī)制，從而 為水稻理想株型育種挖掘基因資源。
[0005] 主要參考文獻(xiàn)： Sasaki A， Ashikari M， Ueguchi-Tanaka M， Itoh Hj et al. Green revolution: a mutant gibberelI ins-synthesis gene in rice. Nature 2002，416:701-702. Zhou F， Lin Q， Zhu L， Ren Y， et al. D14-SCFD3_dependent degradation of D53 regulates strigolactone signaling. Nature 2013， 504:406-410. Li X， Li Jj et al. Control of tillering in rice. Nature 2003， 422:618-621. Ma Xj Cheng Zj Wu Fj Jin M et al. BEAK LIKE SPIKELET1 is required for lateral development of lemma and palea in rice, Plant Mol Biol Rep 2013， 31:98 - 108. Wu Zj Zhang X，He B，et al. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis. Plant Physiol 2007， 145:29-40。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述研究背景，本發(fā)明目的在于分離克隆同時調(diào)控水稻株高、分蘗和葉形相 關(guān)基因(大寫斜體表示，下同)，該基因的表達(dá)量能夠顯著影響水稻株高、分蘗數(shù)、葉寬 和葉長，表明該基因可應(yīng)用在水稻株型和葉形的分子育種中。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種調(diào)控水稻株高、分蘗數(shù)和葉形相關(guān)基因 PALSl編 碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0008] 本發(fā)明分離克隆來源于日本晴的PALSl蛋白（大寫正體表示，下同)的氨基酸序列。 本發(fā)明也包括與SEQ ID N0:3所示的氨基酸序具有80%同源性以上的氨基酸序列，以及因 插入、替換或者缺失一個或者多個氨基酸而產(chǎn)生的衍生物。
[0009] 本發(fā)明還提供所述蛋白質(zhì)的編碼基因分，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 (本 發(fā)明分離克隆來源于水稻品種"日本晴"的基因的核苷酸序列，序列全長13848 bp) 或SEQ ID N0:2(本發(fā)明分離克隆來源于日本晴的基因的蛋白編碼核苷酸序列，序列 全長6780 bp)所示。本發(fā)明也包括與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列有 80%以上同源性的基因序列，也包括因插入、替換或者缺失一個或多個堿基而產(chǎn)生的突變體 等位基因或衍生物。
[0010] 本發(fā)明還提供一種干擾載體，其是選取權(quán)利要求2所述分基因的保守序列作 為特異干擾區(qū)。
[0011] 所述的干擾載體，其利用PLHRNAi干擾載體做為骨架構(gòu)建得到。
[0012] 所述的干擾載體，進(jìn)一步地，其選取所述基因 ⑶S 1040-1385區(qū)間的346 bp 的保守序列作為特異干擾區(qū)。
[0013] 本發(fā)明還提供一種所述基因的質(zhì)粒以及基因的植物表達(dá)載體。
[0014] 一種宿主細(xì)胞，其含有所述的基因。
[0015] 所述的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明還提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法：包括使用SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2 所示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，以及由此所獲得的水稻植株。
[0017] 本發(fā)明還提供所述的基因或所述干擾載體的用途，其用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水 稻，得到改變株型和葉形的轉(zhuǎn)基因水稻，所述轉(zhuǎn)基因水稻至少具有如下一種特征 ： 1) 所述轉(zhuǎn)基因水稻的株高小于所述轉(zhuǎn)化水稻品種； 2) 所述轉(zhuǎn)基因水稻的分蘗數(shù)小于所述轉(zhuǎn)化水稻品種； 3) 所述轉(zhuǎn)基因水稻的葉寬和葉長小于所述轉(zhuǎn)化水稻品種； 所述水稻具體為粳稻。
[0018] 本發(fā)明克隆的水稻產(chǎn)也分基因的遺傳密碼提前終止的突變體/7W (小寫斜體表 示，下同）在形態(tài)上表現(xiàn)出株高變矮、分蘗數(shù)降低和葉片面積減少（見實施例1，圖1)。正常 功能的基因被干擾后植株表現(xiàn)為/73/57突變體表型(見實施例3,圖4)。
[0019] 實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下： 1.本發(fā)明的水稻突變體來自日本晴T-DNA插入突變體庫，但突變體表型不與 T-DNA插入位點(diǎn)共分離。/7W通過與日本晴雜交，證明該突變體性狀受隱形單基因控制。
[0020] 2.利用圖位克隆技術(shù)和功能互補(bǔ)實驗，成功克隆了株型相關(guān)基因。
[0021] 詳細(xì)的技術(shù)發(fā)明細(xì)節(jié)在《【具體實施方式】》中列出。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是： 本發(fā)明克隆了一個同時控制水稻株高、分蘗和葉形的株型相關(guān)基因該基因?qū)?于CHR4/MI-2-LIKE基因家族，將干擾基因表達(dá)的載體轉(zhuǎn)化水稻，獲得的轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)， 分基因的表達(dá)量可以顯著影響水稻株高、分蘗數(shù)、葉寬和葉長，表明該基因在水稻株型 和葉形分子育種中具有一定的應(yīng)用潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1 :野生型和突變體的表型比較，其中，A :野生型與突變體苗期表型， 左為野生型，右為突變體;B :野生型與突變體分蘗期表型，左為野生型，右為突變體 /Λ3/57 ;C :野生型與突變體分蘗期葉片表型，左為野生型，右為突變體/73/57。
[0024] 圖2 分基因定位圖，其中，A 分基因精細(xì)定位圖；B 分基因結(jié)構(gòu)圖以 及突變體基因突變位點(diǎn)。
[0025] 圖3 :構(gòu)建pLHRNAi-PALSl干擾載體所用的載體pLHRNAi結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026] 圖4:干擾產(chǎn)也分基因轉(zhuǎn)基因植株檢測，其中，A :左為日本晴轉(zhuǎn)化空干擾載 體PLHRNAiTtl轉(zhuǎn)基因植株，表型與普通日本晴無明顯變化；右為日本晴轉(zhuǎn)化干擾載體 pLHRNAi-PALSl Ttl轉(zhuǎn)基因植株，表現(xiàn)出/7W突變體表型，株高降低，分蘗數(shù)減少，葉寬和葉 長都變小；B :用Real-time PCR方法檢測陽性pLHRNAi-PALSl轉(zhuǎn)基因植株分基因的表 達(dá)量。

【具體實施方式】
[0027] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0028] 實施例1 :野生型和突變體的表型分析 在成熟期測量株高，方法是從穗子頂端到最底下一節(jié)用直尺量；分蘗數(shù)為成熟期有效 分蘗數(shù)目；劍葉長度是選取植株的主穗劍葉測量，劍葉寬度是在主穗劍葉的最寬處測量的 數(shù)值。每個農(nóng)藝性狀測量25個單株。根據(jù)測定的數(shù)值計算平均值，做t測驗計算P值，結(jié) 果見表1。
[0029] 結(jié)果顯示：與野生型相比，突變體株高顯著降低，分蘗數(shù)顯著減少，劍葉長度和寬 度顯著變小。
[0030] 表L野生型和突變體農(nóng)藝性狀比較（2014年，北京）

【權(quán)利要求】
1. 一種與水稻株高、分蘗數(shù)和葉形相關(guān)的蛋白質(zhì)PALS1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。
2. 如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的編碼基因分，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2 所示。
3. -種干擾載體，其特征在于：選取權(quán)利要求2所述分基因的保守序列作為特異 干擾區(qū)。
4. 如權(quán)利要求3所述的干擾載體，其特征在于：其利用pLHRNAi干擾載體做為骨架構(gòu) 建得到。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的干擾載體，其特征在于：其選取權(quán)利要求2所述基 因⑶S 1040-1385區(qū)間的346 bp的保守序列作為特異干擾區(qū)。
6. 包含權(quán)利要求2所述基因的質(zhì)粒以及基因的植物表達(dá)載體。
7. 宿主細(xì)胞，其特征在于：該宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求2所述的基因或者基因的一部分。
8. 如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于：該細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞或 植物細(xì)胞。
9. 一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法：其特征在于包括使用SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所 示的核苷酸序列的基因轉(zhuǎn)化水稻細(xì)胞，以及由此所獲得的水稻植株。
10. 如權(quán)利要求2所述的分基因或權(quán)利要求3-5任一項所述干擾載體的用途，其特 征在于：用于構(gòu)建轉(zhuǎn)化水稻的轉(zhuǎn)基因載體，得到改變株型和葉形的轉(zhuǎn)基因水稻，所述轉(zhuǎn)基因 水稻至少具有如下一種特征： 1) 所述轉(zhuǎn)基因水稻的株高小于所述轉(zhuǎn)化水稻品種； 2) 所述轉(zhuǎn)基因水稻的分蘗數(shù)少于所述轉(zhuǎn)化水稻品種； 3) 所述轉(zhuǎn)基因水稻的葉寬和葉長小于所述轉(zhuǎn)化水稻品種； 所述水稻具體為粳稻。
【文檔編號】C12N5/10GK104402981SQ201410691772
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】馬小定, 韓龍植, 馬建, 曹桂蘭, 雷財林, 張欣 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所