一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1a的特異引物組合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的特異引物組合，包括ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，本發(fā)明同時還提供了根據(jù)上述引物組合來鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，步驟如下：首先提取目標(biāo)植物基因組，然后以基因組為模板，用權(quán)利要求1所述的特異引物組合進(jìn)行PCR檢測。本發(fā)明根據(jù)能鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的ISSR引物擴(kuò)增序列設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增，可以快速從其他水稻品種中鑒定三系雜交水稻不育系駿1A。本發(fā)明提供的三系雜交水稻不育系駿1A的鑒定方法，可用于上述水稻品種的純度鑒定，進(jìn)而在輔助其育種中進(jìn)行應(yīng)用。
【專利說明】-種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的特異引物組合

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于檢測三系雜交水稻不育系駿IA 的特異引物組合。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國是世界上最大的雜交水稻種子生產(chǎn)國和消費國，具有龐大的雜交水稻種子市 場。目前國內(nèi)雜交水稻年種植面積約占水稻年種植總面積的59%以上，使水稻產(chǎn)量大幅度 提高，為保障我國的糧食安全做出了重要貢獻(xiàn)。獲得高純度的雜交種子是充分發(fā)揮雜種優(yōu) 勢增產(chǎn)潛力的基礎(chǔ)。機械混雜和生物學(xué)混雜是三系雜交水稻親本雜株的主要來源。種子純 度是衡量雜交水稻種子質(zhì)量的主要指標(biāo)，純度的下降將導(dǎo)致作物產(chǎn)量和質(zhì)量的明顯降低。 低純度、真實性差的雜交水稻種子給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大損失，是種子質(zhì)檢部門、育種研究單 位、制種單位和種子公司共同關(guān)心的問題。三系雜交水稻不育系的純度是制約雜交稻生產(chǎn) 的關(guān)鍵因素。
[0003] 三系雜交水稻不育系"駿1A"為本 申請人:自主培育的，不育系"駿1A"與恢復(fù)系 "R0172"配組育成的三系雜交中稻品種"駿優(yōu)172"，以及不育系"駿1A"與恢復(fù)系"R522"配 組育成的三系雜交早熟中稻品種"駿優(yōu)522"，均已通過湖北省品種審定，抗稻瘟病，米質(zhì)優(yōu)， 是適合湖北省恩施州種植的農(nóng)作物新品種。
[0004] 在實現(xiàn)上述研發(fā)的過程中，本申請的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題：
[0005] 沒有鑒定三系雜交水稻不育系"駿1A"的特異引物，無法將上述水稻品種與其親本 區(qū)分開，不能對其進(jìn)行快速的種子純度分子標(biāo)記鑒定和相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種等工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的特異引物組合，解決了

【背景技術(shù)】中的問題，采用該引物組合能夠快速、準(zhǔn)確的對三系雜交水稻不育系駿IA進(jìn)行鑒 定。
[0007] 實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的特異引物組合，包括ZJJU01、 ZJJU02、ZJJU03和ZJJU04，其中ZJJUOl正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ；
[0009] ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ;
[0010] ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ;
[0011] ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ;
[0012] ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;
[0013] ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCTTTTCGGCCAGGA ;
[0014] ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ;
[0015] ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
[0016] 本發(fā)明同時還提供了根據(jù)上述引物組合來鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的方 法，步驟如下：首先提取目標(biāo)植物基因組，然后以基因組為模板，用權(quán)利要求1所述的特異 引物組合進(jìn)行PCR檢測。
[0017] 所述的PCR反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個循環(huán)降 低 0.7°C，72°C延伸 lmin30s，15 個循環(huán)；
[0018] 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循環(huán)；72°C后延伸 lOmin。
[0019] 所述的PCR反應(yīng)體系為：50ng/y 1的DNA模板0. 8μ 1，10XPCR緩沖液1μ 1，2. 5mM dNTPs 0. 8 μ 1，10 μ M 正、反向引物各 0. 2 μ 1，DNA 聚合酶 0. 5U，ddH20 補足至 10 μ 1。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種含有上述特異引物組合的檢測試劑盒。
[0021] 上述試劑盒能夠在鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的純度以及輔助其育種中進(jìn)行 應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)能鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的ISSR引物擴(kuò)增序列設(shè)計引物，通 過PCR擴(kuò)增，可以快速從其他水稻品種中鑒定三系雜交水稻不育系駿1Α。本發(fā)明提供的三 系雜交水稻不育系駿IA的鑒定方法，可用于上述水稻品種的純度鑒定，進(jìn)而在輔助其育種 中進(jìn)行應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本實施例中通過PCR反應(yīng)在水稻中的擴(kuò)增結(jié)果圖A
[0024] 圖2為本實施例中通過PCR反應(yīng)在水稻中的擴(kuò)增結(jié)果圖Β。

【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖以及具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范 圍并不局限于以下實施例。
[0026] 以下實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 的《分子克隆：實驗室手冊》（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中 所述的條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。所用試劑均為市售商品。
[0027] 本實施例提供的用于鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的特異引物組合，包括 ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03 和 ZJJU04,其中 ZJJU01 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ；
[0028] ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ;
[0029] ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ;
[0030] ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ;
[0031] ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;
[0032] ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCTTTTCGGCCAGGA ;
[0033] ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ;
[0034] ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
[0035] 本實施例中采用上述引物組合來鑒定三系雜交水稻不育系駿IA的方法，步驟如 下：
[0036] 1.實驗材料
[0037] I. 1植物材料
[0038] 中駿優(yōu)1及其親本不育系418A、保持系418B和恢復(fù)系R964,中駿優(yōu)1的相似來源 不育系中九A和保持系中九B ;駿優(yōu)522及其未本不育系駿1A、保持系駿IB和恢復(fù)系R522， 駿優(yōu)522的的相似來源不育系福伊A和保持系福伊B。
[0039] L 2酶與試劑
[0040] 分子生物學(xué)試劑，TAKARA rTaq DNA聚合酶，10XPCR緩沖液，dNTP Mixture (2. 5mM)購自大連寶生物公司。
[0041] 其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成。
[0042] 1. 3實驗儀器
[0043] 振蕩破碎儀（Geno/grinder, USA);
[0044] PCR 擴(kuò)增儀：PTC-1OOTM (MJ, USA);
[0045] 核酸電泳儀：DYYIII型YY0115-94(北京六一儀器廠）；
[0046] DNA電泳分析系統(tǒng)：GeneSnap凝膠成像分析系統(tǒng)；
[0047] 其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。
[0048] 2.實驗方法
[0049] 2. 1水稻基因組DNA的提取
[0050] 水稻單粒種植，取幼嫩葉片作為DNA提取材料，依照參照冷泉港實驗室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin 和 Kaaren A. Janssen 編著的 《分子克隆》一書提取水稻材料的總DNA。
[0051] 2.2PCR 擴(kuò)增
[0052] 根據(jù)能鑒定三系雜交水稻不育系駿IA及其組合的ISSR引物擴(kuò)增序列設(shè)計的特異 引物，利用該4對引物組合，以水稻基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.
[0053] PCR 擴(kuò)增體系為：10XPCR 緩沖液 1μ l，2.5mM dNTPs 0·6μ 1，10μΜ 正、反向引物 各(λ 2 μ 1，DNA 聚合酶(λ 5U，50ng/μ I DNA 模板(λ 5 μ 1，ddH 20 補足至 10 μ 1。
[0054] PCR擴(kuò)增程序：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，（其中每個循環(huán)降低 0. 7°C ) 72°C延伸 lmin30s，15 個循環(huán)；94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循 環(huán)；72°C后延伸10min。
[0055] 3.實驗結(jié)果
[0056] 擴(kuò)增均以無菌水為陰性對照，只有當(dāng)陰性對照擴(kuò)增無任何帶型，則說明PCR結(jié)果 可靠。統(tǒng)計被檢測材料的擴(kuò)增帶，陰性計為〇,陽性計為1。統(tǒng)計結(jié)果和聚類分析結(jié)果如下 表以及圖1和圖2所示。結(jié)果表明，本發(fā)明的4對分子標(biāo)記組合可以將三系雜交水稻不育 系駿IA與其組合區(qū)分開。
[0057] 4對分子標(biāo)記引物組合擴(kuò)增2個三系雜交水稻組合的指紋圖譜統(tǒng)計
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的特異引物組合，其特征在于：包括 ZJJU01、ZJJU02、ZJJU03 和 ZJJU04,其中 ZJJU01 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 1 : GAGAGAGAGAGAGAGACACTATTAACG ； ZJJU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :GAGAGAGAGAGAGAGACGGAGG ; ZJJU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :TCTCTCTCTCTCTCTCAAACAGAA ; ZJJU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :CTCTCTCTCTCTCTCACTGTCG ; ZJJU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TCAGTAGCTGTGTCTCAGAACTATGAC ;ZJJU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :GTACCTCmTCGGCCAGGA ; ZJJU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :GGATAATCCGCATCAAGAAG ; ZJJU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :GGTCACCCGAGAATTGCAT。
2. -種基于權(quán)利要求1所述的引物組合的鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，其特 征在于步驟如下：首先提取目標(biāo)植物基因組，然后以基因組為模板，用權(quán)利要求1所述的特 異引物組合進(jìn)行PCR檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，其特征在于：所述的 PCR反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個循環(huán)降低0. 7°C，72°C延 伸lmin30s，15個循環(huán)； 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個循環(huán)；72°C后延伸 10min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的方法，其特征在 于：所述的PCR反應(yīng)體系為：50ng/iil的DNA模板0.8iil，10XPCR緩沖液liil，2.5mM dNTPs0.8ii l，10iiM 正、反向引物各 0.2ii 1，DNA 聚合酶 0.5U，ddH20 補足至 10ii 1。
5. -種含有權(quán)利要求1所述特異引物組合的檢測試劑盒。
6. 權(quán)利要求5所述試劑盒在鑒定三系雜交水稻不育系駿1A的純度以及輔助其育種中 的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404147SQ201410693230
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】徐鑫, 劉學(xué)群, 譚艷平, 王春臺, 熊杰 申請人:中南民族大學(xué)