一種鑒定水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合，包括JU01、JU02、JU03和JU04，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1～8所示，本發(fā)明同時(shí)還提供了根據(jù)上述引物組合來鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，步驟如下：首先提取目標(biāo)植物基因組，然后以基因組為模板，用權(quán)利要求1所述的特異引物組合進(jìn)行PCR檢測(cè)。本發(fā)明根據(jù)能鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的ISSR引物擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增，可以快速?gòu)钠渌酒贩N中鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本。本發(fā)明提供的三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的鑒定方法，可用于上述水稻品種的純度鑒定，進(jìn)而在輔助其育種中進(jìn)行應(yīng)用。
【專利說明】-種鑒定水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于檢測(cè)三系雜交水稻品種駿優(yōu) 522及其親本的特異引物組合。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)是世界上最大的雜交水稻種子生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，具有龐大的雜交水稻種子市 場(chǎng)。目前國(guó)內(nèi)雜交水稻年種植面積約占水稻年種植總面積的59%以上，使水稻產(chǎn)量大幅度 提高，為保障我國(guó)的糧食安全做出了重要貢獻(xiàn)。獲得高純度的雜交種子是充分發(fā)揮雜種優(yōu) 勢(shì)增產(chǎn)潛力的基礎(chǔ)。機(jī)械混雜和生物學(xué)混雜是三系雜交水稻親本雜株的主要來源。種子純 度是衡量雜交水稻種子質(zhì)量的主要指標(biāo)，純度的下降將導(dǎo)致作物產(chǎn)量和質(zhì)量的明顯降低。 低純度、真實(shí)性差的雜交水稻種子給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來極大損失，是種子質(zhì)檢部門、育種研究單 位、制種單位和種子公司共同關(guān)心的問題。
[0003] 三系雜交水稻不育系"駿1A"為本 申請(qǐng)人:自主培育的，不育系"駿1A"與恢復(fù)系 "R0172"配組育成的三系雜交中稻品種"駿優(yōu)172"，以及不育系"駿1A"與恢復(fù)系"R522"配 組育成的三系雜交早熟中稻品種"駿優(yōu)522"，均已通過湖北省品種審定，抗稻瘟病，米質(zhì)優(yōu)， 是適合湖北省恩施州種植的農(nóng)作物新品種。
[0004] 在實(shí)現(xiàn)上述研發(fā)的過程中，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題：
[0005] 沒有鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物，無法將上述水稻品種 與其親本區(qū)分開，不能對(duì)其進(jìn)行快速的種子純度分子標(biāo)記鑒定和相關(guān)的分子標(biāo)記輔助育種 等工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組 合，解決了【背景技術(shù)】中的問題，采用該引物組合能夠快速、準(zhǔn)確的對(duì)三系雜交水稻品種駿優(yōu) 522及其親本進(jìn)行鑒定。
[0007] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合，包 括包括JU01、JU02、JU03和JU04,其中JUOl正向引物如序列表中SEQIDNO. 1 : CACACACACACACACAGAGAACAG；
[0009]JU 01 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 2:CACACACACAGAGAGGGAAAGA;
[0010]JU 02 正向引物如序列表中 SEQIDNO. 3:GGATAATCCGCATCAAGAAGAT;
[0011]JU 02 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 4:GGTCACCCGAGAATTGCATT;
[0012] JU 03 正向引物如序列表中 SEQIDNO. 5:TGAGGCAACAATGCCTATTGCGGA ;
[0013]JU 03 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 6:TATGAGTTCACTATGTGGAGGCTC;
[0014]JU 04 正向引物如序列表中 SEQIDNO. 7:AACAATGCCCAAACTTGAGAG;
[0015]JU 04 反向引物如序列表中 SEQIDNO. 8 :CGGGTCCACATGTCAGTGAG。
[0016] 本發(fā)明同時(shí)還提供了根據(jù)上述引物組合來鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其 親本的方法，步驟如下：首先提取目標(biāo)植物基因組，然后以基因組為模板，用權(quán)利要求1所 述的特異引物組合進(jìn)行PCR檢測(cè)。
[0017] 所述的PCR反應(yīng)條件為：95°C5min;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個(gè)循環(huán)降 低 0.7°C，72°C延伸lmin30s，15 個(gè)循環(huán)；
[0018] 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 10min。
[0019]所述的PCR反應(yīng)體系為：50ng/ μ1的DNA模板0.8μ1，10 XPCR緩沖液1μ1， 2. 5mMdNTPs(λ8μ1，10μM正、反向引物各(λ2μ1，DNA聚合酶(λ5U，CldH2O補(bǔ)足至 10μ1。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種含有上述特異引物組合的檢測(cè)試劑盒。
[0021] 上述試劑盒能夠在鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的純度以及輔助其 育種中進(jìn)行應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明根據(jù)能鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的ISSR引物擴(kuò)增序列設(shè) 計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增，可以快速?gòu)钠渌酒贩N中鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親 本。本發(fā)明提供的三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的鑒定方法，可用于上述水稻品種 的純度鑒定，進(jìn)而在輔助其育種中進(jìn)行應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本實(shí)施例中通過PCR反應(yīng)在水稻中的擴(kuò)增結(jié)果圖A ;
[0024] 圖2為本實(shí)施例中通過PCR反應(yīng)在水稻中的擴(kuò)增結(jié)果圖Β。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖以及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范 圍并不局限于以下實(shí)施例。
[0026] 以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 的《分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，2001)中 所述的條件，或按照儀器或試劑制造廠商所建議的條件。所用試劑均為市售商品。
[0027] 本實(shí)施例提供的用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物 組合，包括JU01、JU02、JU03和JU04,其中JUOl正向引物如序列表中SEQIDNO. 1: CACACACACACACACAGAGAACAG；
[0028]JU 01 反向引物如序列表中SEQIDNO. 2 :CACACACACAGAGAGGGAAAGA;
[0029]JU 02 正向引物如序列表中SEQIDNO. 3 :GGATAATCCGCATCAAGAAGAT;
[0030]JU 02 反向引物如序列表中SEQIDNO. 4 :GGTCACCCGAGAATTGCATT;
[0031]JU 03 正向引物如序列表中SEQIDNO. 5 :TGAGGCAACAATGCCTATTGCGGA;
[0032]JU 03 反向引物如序列表中SEQIDNO. 6 :TATGAGTTCACTATGTGGAGGCTC;
[0033]JU 04 正向引物如序列表中SEQIDNO. 7 :AACAATGCCCAAACTTGAGAG;
[0034]JU04反向引物如序列表中SEQIDNO. 8 :CGGGTCCACATGTCAGTGAG。本實(shí)施例中采 用上述引物組合來鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，步驟如下：
[0035] 1.實(shí)驗(yàn)材料
[0036] I. 1植物材料
[0037] 中駿優(yōu)1及其親本不育系418A、保持系418B和恢復(fù)系R964,中駿優(yōu)1的相似來源 不育系中九A和保持系中九B;駿優(yōu)522及其未本不育系駿1A、保持系駿IB和恢復(fù)系R522， 駿優(yōu)522的的相似來源不育系福伊A和保持系福伊B。
[0038] 1. 2酶與試劑
[0039] 分子生物學(xué)試劑，TAKARArTaqDNA聚合酶，10XPCR緩沖液，dNTP Mixture(2. 5mM)購(gòu)自大連寶生物公司。
[0040] 其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 合成。
[0041] 1.3實(shí)驗(yàn)儀器
[0042]振蕩破碎儀（Geno/grinder, USA);
[0043]PCR擴(kuò)增儀：PTC-1OOTM(MJ,USA);
[0044] 核酸電泳儀：DYYIII型ΥΥ0115_94(北京六一儀器廠）；
[0045] DNA電泳分析系統(tǒng)：GeneSnap凝膠成像分析系統(tǒng)；
[0046] 其它儀器包括：恒溫水浴鍋、電子天平、離心機(jī)、渦旋儀、純水儀、恒溫培養(yǎng)箱等。
[0047] 2.實(shí)驗(yàn)方法
[0048] 2. 1水稻基因組DNA的提取
[0049] 水稻單粒種植，取幼嫩葉片作為DNA提取材料，依照參照冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社 (Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、Nina Irwin和Kaaren A. Janssen編著的 《分子克隆》一書提取水稻材料的總DNA。
[0050] 2. 2PCR擴(kuò)增
[0051] 根據(jù)能鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的ISSR引物擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)的特 異引物，利用該4對(duì)引物組合，以水稻基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增.
[0052]PCR擴(kuò)增體系為：10XPCR緩沖液 1μl，2.5mMdNTPs0·6μ1，10μΜ正、反向引物 各 0· 2μ1，DNA聚合酶 0· 5U，50ng/yIDNA模板 0· 5μ1，ddH2 0 補(bǔ)足至 10μ1。
[0053]PCR擴(kuò)增程序：95°C5min;95°C變性30s，65°C退火40s，（其中每個(gè)循環(huán)降低 0. 7°C) 72°C延伸lmin30s，15 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個(gè)循 環(huán)；72°C后延伸10min。
[0054] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0055] 擴(kuò)增均以無菌水為陰性對(duì)照，只有當(dāng)陰性對(duì)照擴(kuò)增無任何帶型，則說明PCR結(jié)果 可靠。統(tǒng)計(jì)被檢測(cè)材料的擴(kuò)增帶，陰性計(jì)為〇,陽(yáng)性計(jì)為1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果和聚類分析結(jié)果如下 表以及圖1和圖2所示。結(jié)果表明，本發(fā)明的4對(duì)分子標(biāo)記組合可以將三系雜交水稻品種 駿優(yōu)522及其親本區(qū)分開。
[0056] 4對(duì)分子標(biāo)記引物組合擴(kuò)增2個(gè)三系雜交水稻組合的指紋圖譜統(tǒng)計(jì)
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的特異引物組合，其特征 在于：包括JU01、JU02、JU03和JU04,其中JU01正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 : CACACACACACACACAGAGAACAG ； JU 01 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 2 :CACACACACAGAGAGGGAAAGA ; JU 02 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 3 :GGATAATCCGCATCAAGAAGAT ; JU 02 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 4 :GGTCACCCGAGAATTGCAIT ; JU 03 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 5 :TGAGGCAACAATGCCTAITGCGGA ; JU 03 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 6 :TATGAGITCACTATGTGGAGGCTC ; JU 04 正向引物如序列表中 SEQ ID NO. 7 :AACAATGCCCAAACTTGAGAG ; JU 04 反向引物如序列表中 SEQ ID NO. 8 :CGGGTCCACATGTCAGTGAG。
2. -種基于權(quán)利要求1所述的引物組合的鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的 方法，其特征在于步驟如下：首先提取目標(biāo)植物基因組，然后以基因組為模板，用權(quán)利要求 1所述的特異引物組合進(jìn)行PCR檢測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，其特征 在于：所述的PCR反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C變性30s，65°C退火40s，其中每個(gè)循環(huán)降低 0? 7°C，72°C延伸 lmin30s，15 個(gè)循環(huán)； 94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 2min，25 個(gè)循環(huán)；72°C后延伸 10min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的方法，其特 征在于：所述的PCR反應(yīng)體系為：50ng/iil的DNA模板0. 8iil，10XPCI^^4^1ia，2.5mM dNTPs 0. l，10iiM 正、反向引物各 0. 1，DNA 聚合酶 0. 5U，ddH20 補(bǔ)足至 10ii 1。
5. -種含有權(quán)利要求1所述特異引物組合的檢測(cè)試劑盒。
6. 權(quán)利要求5所述試劑盒在鑒定三系雜交水稻品種駿優(yōu)522及其親本的純度以及輔助 其育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104357576SQ201410693416
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】徐鑫, 劉學(xué)群, 譚艷平, 王春臺(tái), 熊杰 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)