一種鑒定豬耳面積大小的方法及其專用引物對的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定豬耳面積大小的方法及其專用引物對。本發(fā)明公開一種擴(kuò)增含有g(shù).12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段的引物對；所述g.12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)為GenBank Accession Number為NC_010447.4的序列的自5’末端起第12774位；所述GenBank Accession Number為NC_010447.4的序列的更新日為2013年9月29日。本發(fā)明公開的方法操作簡單、準(zhǔn)確度高、可實(shí)現(xiàn)自動化檢測，將在豬育種中發(fā)揮巨大作用。
【專利說明】一種鑒定豬耳面積大小的方法及其專用引物對

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定豬耳面積大小的方法及其專用引物對，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 我國養(yǎng)豬的歷史可謂悠久，鑒于大耳文化的熏陶，我國很多地方豬品種多數(shù)都具 有一雙大耳，尤其以太湖豬為甚。受不同地域耳文化的影響，不同地域?qū)ωi耳大小的選擇方 向性存在巨大差異，于是就出現(xiàn)了不同豬種豬耳大小和形態(tài)的豐富多樣性。甚至對于一些 地方豬品種如大耳的二花臉豬、東北民豬和小耳的滇南小耳豬、廣東小耳花豬等，耳大小已 經(jīng)成為了其品種特異性標(biāo)志之一。
[0003] 豬耳面積性狀QTL定位及主效基因研究已經(jīng)在國內(nèi)外研究中開展。英國羅斯林研 究所研究人員利用大白豬X梅山豬F2設(shè)計(jì)資源群體，耳面積性狀顯著QTL分別被定位于 5 號染色體上 51cM 和 7 號染色體上 70cM 處（Wei WH, de Koning DJ, Penman JC, Finlayson HAj Archibald AL, Haley CS:QTL modulating ear size and erectness in pigs. Anim Genet 2007,38:222-226.)。另外，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究人員利用白色杜洛克X二花臉F2 設(shè)計(jì)資源群體開展了耳面積性狀QTL定位研究，分別將QTL定位于5號染色體上70cM 和 7 號染色體上 58cM 處（Ma J，Qi W，Ren D，Duan Y，Qiao R，Guo Y，Yang Z，Li L，Milan D，Ren J，Huang LA genome scan for quantitative trait loci affecting three ear traits in a White DurocXChinese Erhualian resource population. Anim Genet 2009, 40:463-467.)，且這兩個QTL分別可以解釋45%和17%的表型變異。其中，在5號 染色體上耳面積性狀QTL區(qū)間內(nèi)存在一個WIFl基因，此基因作為Wnt分子的胞外抑制劑 sFRP家族成員之一，通過直接與Wnt分子結(jié)合，抑制Wnt分子與受體細(xì)胞膜上的Frizzled 受體及輔助受體LRP5/6形成三聚體復(fù)合物，從而抑制了 Wnt信號通路信號傳導(dǎo)，可影響脂 肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等的分化和增殖（Kawano Y，Kypta R. Secreted antagonists of the Wnt signalling pathway. J Cell Sci 2003,116:2627-2634·)。美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院和法 國雷恩大學(xué)的研究人員，分別對多個具有豐富耳面積多樣性的家養(yǎng)狗品種，開展了全基因 組關(guān)聯(lián)研究和全基因組選擇信號研究，結(jié)果表明WIFl基因可作為將耳面積性狀主效候選 基因 （Boyko AR, Quignon Pj Li L，Schoenebeck JJ，Degenhardt JDj Lohmueller KEj Zhao K，Brisbin A，Parker HG, vonHoldt BM，Cargill M，Auton A, Reynolds A，Elkahloun AG, Castelhano M，Mosher DS，Sutter NB, Johnson GSj Novembre Jj Hubisz MJ，Siepel A,Wayne RK，Bustamante CD, Ostrander EA. A simple genetic architecture underlies morphological variation in dogs. PLoS Biol 2010,8:el00045L ；Vaysse A, Ratnakumar A, Derrien Tj Axelsson Ej Rosengren Pielberg Gj Sigurdsson Sj Fall Tj SeppalaEHj Hansen MS,Lawley CT，Karlsson EK ;LUPA Consortium,Bannasch Dj VilaCj Lohi H，Galibert F，F(xiàn)redholm M， Haggstrom J，Hedhammar A, AndreCj Lindblad-Toh K，Hitte Cj Webster MT. Identification of genomic regions associated with phenotypic variation between dog breeds using selection mapping. PLoS Genet 2011，7: el002316.)。綜合上述研究，WIFl基因可作為耳面積性狀主效候選基因，具有很高 研究價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種鑒定豬耳面積大小的方法及其專用引物對。
[0005] 本發(fā)明提供一種擴(kuò)增含有g(shù). 127740T多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段的引物對；
[0006] 所述 g. 127740T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0007] 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的更新日為 2013 年 9 月 29臼。
[0008] 上述引物對中，所述引物對由SEQ ID No. 1所示的DNA分子和SEQ ID No. 2所示 的DNA分子組成。
[0009] -種鑒定或輔助鑒定豬的耳面積大小的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該試劑 盒包含上述任一所述的引物對。
[0010] 一種鑒定或輔助鑒定豬的耳面積大小的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該方法 為：純合CC基因型的豬的耳面積大于雜合CT基因型的豬的耳面積，雜合CT基因型的豬的 耳面積大于純合TT基因型的豬的耳面積；
[0011] 所述純合CC基因型的豬為g. 127740T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為C的豬；
[0012] 所述雜合CT基因型的豬為g. 127740T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基為T和C的豬；
[0013] 所述純合TT基因型的豬為g. 127740T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為T的豬；
[0014] 所述 g. 127740T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0015] 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的更新日為 2013 年 9 月 29臼。
[0016] 上述方法中，所述純合CC基因型、雜合CT基因型或純合TT基因型的判定方法如 下：以豬的基因組DNA為模板，以上述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基均為C，則所述豬的基因型為純合CC基因型，如 果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基為T和C，則所述豬的基因型為雜合CT基因 型，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基均為T，則所述豬的基因型為純合TT基 因型。
[0017] 一種選育耳面積大的豬的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，是選擇純合CC基因型 的豬進(jìn)行選育；
[0018] 所述純合CC基因型的豬為g. 127740T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為C的豬；
[0019] 所述 g. 127740T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0020] 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的更新日為 2013 年 9 月 29臼。
[0021] 上述方法中，所述純合CC基因型的判定方法如下：以豬的基因組DNA為模板，以上 述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位 的堿基均為C，則所述豬的基因型為純合CC基因型。
[0022] -種選育耳面積小的豬的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，是選擇純合TT基因型 的豬進(jìn)行選育；
[0023] 所述純合TT基因型的豬為g. 127740T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為T的豬；
[0024] 所述 g. 127740T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序 列的自5'末端起第12774位；
[0025] 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的更新日為 2013 年 9 月 29臼。
[0026] 上述方法中，所述純合TT基因型的判定方法如下：以豬的基因組DNA為模板，以上 述引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位 的堿基均為T，則所述豬的基因型為純合TT基因型。
[0027] 上述任一所述的引物對、上述試劑盒和/或上述任一所述的方法在豬的選育中的 應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明使用基因測序方法檢測g. 12774CXT，只需進(jìn)行PCR 反應(yīng)，測序即可判別個體的基因型，基因型判型非常準(zhǔn)確，檢測費(fèi)用不高，具有很高的育 種實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。用本發(fā)明的方法對豬耳面積性狀進(jìn)行選擇，可使豬平均耳面積增大約 78. 89cm2,從而獲得大耳面積豬。
[0029] 應(yīng)用本發(fā)明提供的方法對豬進(jìn)行育種，可對待選豬進(jìn)行早期篩選，有效地緩解實(shí) 際生產(chǎn)中的選優(yōu)良種豬時間長的問題，降低育種花費(fèi)，有效降低或提高實(shí)際生產(chǎn)中的豬耳 面積。本發(fā)明的檢測方法操作簡單、費(fèi)用不高、準(zhǔn)確度高，并可實(shí)現(xiàn)自動化的直接檢測，在豬 的育種工作中發(fā)揮巨大作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為TT基因型個體和CC基因型個體WIFl基因 g. 12774CXT多態(tài)性位點(diǎn)附近序 列的測序結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 大民雜交豬（Sus scrofa)，由大白豬和民豬雜交獲得，該豬購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平畜禽實(shí)驗(yàn)基地。
[0034] 下述實(shí)施例中的GenBank Accession Number為NC_010447. 4的序列均是指更新 日為 2013 年 9 月 29 日的 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列。
[0035] 實(shí)施例1、鑒定豬耳面積大小
[0036] 一、豬WIFl基因 g. 12774CXT多態(tài)性位點(diǎn)的確定
[0037](一）以兩頭大民雜交豬為實(shí)驗(yàn)材料，分別提取其耳緣組織的基因組DNA。
[0038] (二）引物的設(shè)計(jì)與合成
[0039] 根據(jù)豬 WIFl 基因基因組 DNA 序列（GenBank Accession Number NC_010447. 4)信 息，設(shè)計(jì)并合成如下引物：
[0040] U(上游引物）：5, -CCTTTTCTGTGATGTCTACTCC-3'（SEQ ID No. I);
[0041] D (下游引物）：5, -CAACGCTTATGTGCCCTA-3'（SEQ ID No. 2)。
[0042] (三）PCR 擴(kuò)增
[0043] 分別以步驟（一）得到的大民雜交豬的基因組DNA為模板，以U和D為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別命名為產(chǎn)物1和產(chǎn)物2。
[0044] PCR擴(kuò)增體系：基因組DNA 200ng，10 X PCR擴(kuò)增緩沖液5 μ I，dNTPs終濃度為 10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0. 75U，Mg2+2. 5mmol/L，用CldH2O補(bǔ)足體系至 50 μ 1。
[0045] PCR擴(kuò)增程序：95°C預(yù)變性 5min ;95°C變性 20s，56°C退火 30s，72°C延伸 30s，共 35 個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0046] (四）測序及序列分析
[0047] 將產(chǎn)物1和產(chǎn)物2進(jìn)行測序，得到產(chǎn)物1的序列（如SEQ ID No. 3所示）和產(chǎn)物2 的序列（如SEQ ID No. 4所示）。SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4只存在一個堿基的差異，均為 SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4中自5'末端起第243位，該處的堿基為C或T，該位點(diǎn)附近的反 向互補(bǔ)序列如圖1所示（其中箭頭所示為該多態(tài)性位點(diǎn)），該位點(diǎn)位于GenBank Accession Number為NC_010447. 4的自5'末端起第12774位，因此將該位點(diǎn)命名為g. 127740T。
[0048] 在 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列自 5'末端第 12774 位的喊 基（或步驟（三）得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基）均為C的個體，該個 體為純合型個體，將該個體的基因型命名為純合CC基因型，在GenBank Accession Number 為NC_010447. 4的序列自5'末端第12774位的堿基（或步驟（三）得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 自5'末端起第243位的堿基）均為T的個體，該個體為純合型個體，將該個體的基因型命 名為純合TT基因型，在GenBank Accession Number為NC_010447. 4的序列自5'末端第 12774位的堿基（或步驟（三）得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基）為T和 C的個體，該個體為雜合型個體，將該個體的基因型命名為雜合CT基因型。
[0049] 二、豬WIFl基因 g. 127740T多態(tài)性位點(diǎn)與豬耳面積性狀的關(guān)聯(lián)性分析
[0050] 為確定g. 127740T多態(tài)性位點(diǎn)與豬耳面積性狀是否相關(guān)，以307頭大民雜交豬為 實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行如下試驗(yàn)：
[0051] (一）提取每頭豬的耳緣組織的基因組DNA，分別按照步驟一中（三）的方法進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，按照步驟一中（四）的方法確定每頭豬的基因型是純合CC、 雜合CT還是純合TT。
[0052] (二）測量各基因型豬的耳面積大小。
[0053] (三）根據(jù)豬的基因型以及豬耳面積得到如下結(jié)論：純合CC基因型的豬的豬耳面 積大于雜合CT基因型的豬的豬耳面積，雜合CT基因型的豬的豬耳面積大于純合TT基因型 的豬的豬耳面積。
[0054] (四）用硫酸紙描出豬耳輪廓，使用Photoshop軟件計(jì)算出豬耳面積性狀，對 g. 12774CXT位點(diǎn)與豬耳面積性狀以最小二乘法開展關(guān)聯(lián)分析。所用模型如下：
[0055] Y = S+P+B+G+e
[0056] 其中Y為性狀測定值，S為性別效應(yīng)，P為胎次效應(yīng)，B為屠宰批次效應(yīng)，G為基因 型效應(yīng)，e為殘差效應(yīng)。
[0057] 結(jié)果如表1所示。
[0058] 表1豬的基因型與耳面積的關(guān)聯(lián)性分析
[0059]

【權(quán)利要求】
1. 一種擴(kuò)增含有g(shù). 12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段的引物對； 所述 g. 12774C>T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的更新日為 2013 年 9 月 29 曰。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于：所述引物對由SEQ ID No. 1所示的DNA 分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子組成。
3. -種鑒定或輔助鑒定豬的耳面積大小的試劑盒，該試劑盒包含權(quán)利要求1或2所述 的引物對。
4. 一種鑒定或輔助鑒定豬的耳面積大小的方法，該方法為：純合CC基因型的豬的耳面 積大于雜合CT基因型的豬的耳面積，雜合CT基因型的豬的耳面積大于純合TT基因型的豬 的耳面積； 所述純合CC基因型的豬為g. 12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為C的豬； 所述雜合CT基因型的豬為g. 12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基為T和C的豬； 所述純合TT基因型的豬為g. 12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為T的豬； 所述 g. 12774C>T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的更新日為 2013 年 9 月 29 曰。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述純合CC基因型、雜合CT基因型或純 合TT基因型的判定方法如下：以豬的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求2所述的引物為引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基均為C， 則所述豬的基因型為純合CC基因型，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基為T 和C，則所述豬的基因型為雜合CT基因型，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基 均為T，則所述豬的基因型為純合TT基因型。
6. -種選育耳面積大的豬的方法，是選擇純合CC基因型的豬進(jìn)行選育； 所述純合CC基因型的豬為g. 12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為C的豬； 所述 g. 12774C>T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的更新日為 2013 年 9 月 29 曰。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述純合CC基因型的判定方法如下：以 豬的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求2所述的引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基均為C，則所述豬的基因型為純合CC基 因型。
8. -種選育耳面積小的豬的方法，是選擇純合TT基因型的豬進(jìn)行選育； 所述純合TT基因型的豬為g. 12774C>T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基均為T的豬； 所述 g. 12774C>T 多態(tài)性位點(diǎn)為 GenBank Accession Number 為 NC_010447. 4 的序列的 自5'末端起第12774位； 所述 GenBank Accession Number 為 NC_010447.4 的序列的更新日為 2013年 9 月 29 曰。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述純合TT基因型的判定方法如下：以 豬的基因組DNA為模板，以權(quán)利要求2所述的引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物，如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物自5'末端起第243位的堿基均為T，則所述豬的基因型為純合TT基 因型。
10. 權(quán)利要求1或2所述的引物對、權(quán)利要求3所述的試劑盒和/或權(quán)利要求4-9任一 所述的方法在豬的選育中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104404149SQ201410697378
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月26日
【發(fā)明者】王立賢, 張龍超, 王立剛, 顏華, 梁晶 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所