一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，包括：該方法主要根據(jù)核酸反應(yīng)熱力學(xué)最近鄰模型，計(jì)算DNA以及RNA反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)，從理論上闡明探針特異性的理論極限，同時(shí)計(jì)算出不同單堿基突變的特異性差異與熱力學(xué)性質(zhì)，并在計(jì)算機(jī)上模擬預(yù)測(cè)出不同的核酸反應(yīng)結(jié)果；設(shè)計(jì)出具有理論優(yōu)化過的具有高特異性的核酸探針。本發(fā)明基于熱力學(xué)計(jì)算設(shè)計(jì)出的探針特異性達(dá)到了理論上最優(yōu)結(jié)果；穩(wěn)定性好，保存時(shí)間長；檢測(cè)過程及其簡單；且檢測(cè)時(shí)間短；檢測(cè)過程不受環(huán)境溫度影響，同時(shí)不受溶液中鹽離子濃度影響；該方法能夠滿足臨床需求，在醫(yī)學(xué)方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】-種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸雜交領(lǐng)域，特別設(shè)及一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 核酸是一切生物細(xì)胞的基本成分，在生物體內(nèi)編碼和調(diào)節(jié)遺傳信息的表達(dá)。對(duì)生 物體的生長、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等重大生命現(xiàn)象起著重要作用。核酸的生物重要性促 使核酸探針W及引物在生物技術(shù)如：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR),生物巧片（microarray)及巧光 原位雜交等方面的具有廣泛的應(yīng)用。
[0003] 核酸能夠用于生物學(xué)，生物技術(shù)W及納米生物技術(shù)方面的關(guān)鍵屬性就是其具有可 預(yù)測(cè)性W及特異的Watson -化ick雜交互補(bǔ)特性。然而除非在烙解溫度附近，許多正確堿 基配對(duì)的熱力學(xué)增加會(huì)覆蓋一些錯(cuò)配的熱力學(xué)誤差，而且較長核酸鏈之間的雜交也會(huì)產(chǎn)生 非特異。
[0004] 高溫或化學(xué)變性通常被用于提高雜交的特異性。在高溫或化學(xué)變性條件下，標(biāo)準(zhǔn) 的雜交自由能較弱，基于互補(bǔ)序列之間的結(jié)合力，略微不同的序列就可W被辨別。然而，在 多祀標(biāo)雜交系統(tǒng)中許多不同的雜交反應(yīng)必須同時(shí)進(jìn)行，該個(gè)時(shí)候利用某一烙解溫度附近的 雜交來提高特異性顯然是不可行的。此外，烙解溫度取決于雜交溶液中鹽的濃度、核酸濃 度等一些因素，很難W此預(yù)測(cè)雜交的精確性。同樣，化學(xué)變性也削弱了沃森-克里克堿基配 對(duì)原則，一樣具有潛在的局限性。
[0005] 一般來說一個(gè)理想的核酸探針應(yīng)該滿足=個(gè)條件：高親和力（能夠牢固地和互補(bǔ) 祀標(biāo)結(jié)合）、高選擇性（與錯(cuò)配序列不結(jié)合）W及高穩(wěn)定性（環(huán)境因素不容易影響，不同實(shí) 驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果具有一致性），而該在實(shí)際的實(shí)踐中很難全面滿足。
[0006] 根據(jù)核酸特異性雜交在生物技術(shù)等方面的重要作用W及目前高特異性雜交的方 法仍存在一些缺陷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方 法，該方法針對(duì)傳統(tǒng)高特異性雜交檢測(cè)中存在的問題和不足，采用熱力學(xué)理論及鏈置換探 針高特異核酸雜交條件的優(yōu)化，提出一種衡量高特異性雜交受溫度影響程度的參數(shù)與計(jì)算 方法，為核酸的高特異性雜交W及單堿基突變特異性的檢測(cè)提供有效的方法學(xué)依據(jù)。
[000引本發(fā)明的一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，包括：
[0009] (1)針對(duì)預(yù)檢測(cè)的目的祀標(biāo)X，設(shè)計(jì)多個(gè)結(jié)構(gòu)具有差別并與目的祀標(biāo)相匹配的鏈 置換探針PC，與目的祀標(biāo)序列的反應(yīng)作為反應(yīng)1，反應(yīng)產(chǎn)物為P和XC，與具有單堿基突變的 祀標(biāo)S的反應(yīng)作為反應(yīng)2,反應(yīng)產(chǎn)物為P和SC ;分別計(jì)算反應(yīng)1和反應(yīng)2中每一種核酸分子 的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能A護(hù)、標(biāo)準(zhǔn)滴A 5°^及標(biāo)準(zhǔn)洽A ，并根據(jù)此計(jì)算出反應(yīng)1和反應(yīng)2的 標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變化量A t護(hù)，標(biāo)準(zhǔn)滴變化量A ,5°^及標(biāo)準(zhǔn)洽變化量A 結(jié)合各反應(yīng) 物的初始濃度，最終分別計(jì)算出反應(yīng)1與反應(yīng)2的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量；
[0010] (2)根據(jù)步驟（1)的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量，選出傾向于反應(yīng)1的探針；最后合成選出的探 針，實(shí)現(xiàn)目的祀標(biāo)高特異性檢測(cè)。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0012] (1)對(duì)核酸序列的高特異性檢測(cè)：首先依據(jù)核酸鏈置換探針的反應(yīng)方程式，針對(duì) 該核酸序列計(jì)算出幾種比較合理的探針設(shè)計(jì)方式。然后根據(jù)設(shè)計(jì)好的探針與祀標(biāo)的實(shí)際反 應(yīng)結(jié)果選出特異性最優(yōu)的探針設(shè)計(jì)。從而達(dá)到對(duì)核酸序列的高特異性檢測(cè)的目的。
[0013] (2)對(duì)單堿基突變的高特異性檢測(cè)；首先依據(jù)核酸鏈置換探針的反應(yīng)方程式，針 對(duì)該單堿基突變計(jì)算出幾種比較合理的探針設(shè)計(jì)方式。然后根據(jù)單堿基突變本身的熱力學(xué) 參數(shù)計(jì)算出該突變的溫度特性，選擇出檢測(cè)的最適合的溫度范圍。最后根據(jù)實(shí)際的探針與 祀標(biāo)反應(yīng)結(jié)果，選擇出最優(yōu)化的探針設(shè)計(jì)和反應(yīng)溫度。從而達(dá)到高特異性檢測(cè)單堿基突變 的目的。
[0014] 技術(shù)方案具體為；
[0015] (1)對(duì)核酸序列的高特異性檢測(cè)：
[0016] 核酸鏈置換反應(yīng)方程式為：
[0017] X+PC 一 P巧C 1
[0018] S+PC 一 P+SC 2
[0019] 其中X代表目的祀標(biāo)，PC代表鏈置換探針，P和C分別代表鏈置換探針的兩條核酸 鏈。X與PC經(jīng)過反應(yīng)，X置換出探針PC中的P鏈，從而形成反應(yīng)產(chǎn)物XC與被釋放的P鏈， 經(jīng)過一定時(shí)間后，反應(yīng)達(dá)到平衡，稱該反應(yīng)為反應(yīng)1。W S代表具有單堿基突變的祀標(biāo)，貝U S+PC - SC+P代表突變的祀標(biāo)與探針PC的反應(yīng)方程式，稱該反應(yīng)為反應(yīng)2,反應(yīng)過程與前述 相仿。
[0020] 第一步：根據(jù)預(yù)檢測(cè)的核酸序列，設(shè)計(jì)出與之相匹配的鏈置換探針。
[0021] 計(jì)算出參與"反應(yīng)1"和"反應(yīng)2"中每一種核酸分子的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能A護(hù)，標(biāo) 準(zhǔn)滴AS"化及標(biāo)準(zhǔn)洽AH°。并根據(jù)此計(jì)算出，該反應(yīng)1和反應(yīng)2的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變化 量Af護(hù)，標(biāo)準(zhǔn)滴變化量AtS°W及標(biāo)準(zhǔn)洽變化量A ftf，對(duì)已反應(yīng)1，其計(jì)算公式如下：
[0022] ArG°(l) = AG°aC) + AG°(W-AG°a)-AG°(PC)
[0023] Aftfa) = AH° 狂C) + AH° (巧-AH°〇〇-AH°(PC)
[0024] ArS°(l) = AS° 狂C) + AS° (巧-AS°〇〇-AS°(PC)
[002引其中A貨(1)代表"反應(yīng)1"的標(biāo)準(zhǔn)自由吉布斯能變化量，Aftfa)為"反應(yīng)1"的 標(biāo)準(zhǔn)洽變化量，AtS°(l)為"反應(yīng)1"的標(biāo)準(zhǔn)滴變化量。A護(hù)狂C)、Atf狂C)和AS°aC)分 別為分子XC的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能、標(biāo)準(zhǔn)洽和標(biāo)準(zhǔn)滴。其他的參與反應(yīng)分子的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自 由能，標(biāo)準(zhǔn)洽，標(biāo)準(zhǔn)滴表示方法類似。
[0026] 對(duì)于"反應(yīng)2"，其標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變化量A t護(hù)(2)、標(biāo)準(zhǔn)洽變化量A (2)和標(biāo) 準(zhǔn)滴變化量A (2)的計(jì)算方法與"反應(yīng)1"的計(jì)算方法相同。
[0027] 在得到各個(gè)反應(yīng)方程式的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變化量Af護(hù)、標(biāo)準(zhǔn)洽變化量和 標(biāo)準(zhǔn)滴變化量之后?？蒞進(jìn)一步計(jì)算出"反應(yīng)1"和"反應(yīng)2"的雜交產(chǎn)量：
[002引

【權(quán)利要求】
1. 一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，包括： (1) 針對(duì)預(yù)檢測(cè)的目的靶標(biāo)X，設(shè)計(jì)多個(gè)結(jié)構(gòu)具有差別并與目的靶標(biāo)相匹配的鏈置換 探針PC，與目的靶標(biāo)序列的反應(yīng)作為反應(yīng)1，反應(yīng)產(chǎn)物為P和XC，與具有單堿基突變的靶標(biāo) S的反應(yīng)作為反應(yīng)2,反應(yīng)產(chǎn)物為P和SC ;分別計(jì)算反應(yīng)1和反應(yīng)2中每一種核酸分子的標(biāo) 準(zhǔn)吉布斯自由能AG°、標(biāo)準(zhǔn)熵AS°以及標(biāo)準(zhǔn)焓ΛΗ°，并根據(jù)此計(jì)算出反應(yīng)1和反應(yīng)2的標(biāo) 準(zhǔn)吉布斯自由能變化量AA ci,標(biāo)準(zhǔn)熵變化量Ajtl以及標(biāo)準(zhǔn)焓變化量△ 結(jié)合各反應(yīng)物 的初始濃度，最終分別計(jì)算出反應(yīng)1與反應(yīng)2的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量； (2) 根據(jù)步驟（1)的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量，選出傾向于反應(yīng)1的探針；最后合成選出的探針， 實(shí)現(xiàn)目的靶標(biāo)高特異性檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述步驟⑴中的反應(yīng)1的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能AG°、標(biāo)準(zhǔn)熵AS°以及標(biāo)準(zhǔn)焓ΛΗ°的計(jì) 算公式為： ArG0(I) = Δ G0 (XC) + Δ G0 (P) - Δ G0 (X) - Δ G0 (PC)； ArH0(I) = Δ H0 (XC) + Δ H0 (P) - Δ H0 (X) - Δ H0 (PC)； ArS0(I) = Δ Sci(XC)+ Δ Sci(P)-A Sci(X)-A Sci(PC)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述步驟（1)中的雜交產(chǎn)物產(chǎn)量的計(jì)算公式為：
其中R為理想氣體常數(shù)，T為反應(yīng)溫度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述步驟（1)中的目的靶標(biāo)為已知單堿基突變，通過公式計(jì)算出單堿基突變的溫度特 性，確定檢測(cè)特異性最優(yōu)的溫度范圍；通過溶液中鹽離子濃度變化影響公式，選出受鹽離子 濃度變化影響最小的鏈置換探針。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述溫度特性計(jì)算公式為：Δ ΛΗ = ArHtl⑵_ArH°(l) ; Λ AS = ArStl⑵-ArStl⑴；
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種基于熱力學(xué)優(yōu)化的高特異性核酸雜交方法，其特征在 于：所述鹽離子濃度變化計(jì)算公式為：AS°= AS°[lMNaCl]+0. 368XN/2Xln[Na+]。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104513855SQ201410707763
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】毛紅菊, 武振華, 白亞楠, 金慶輝, 趙建龍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所