一種分離純化谷氨酸脫羧酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用層析技術(shù)從微生物中分離純化谷氨酸脫羧酶的方法，包括以下步驟：1)低溫反復(fù)凍融、溶菌酶破碎菌體；(2)鹽析：飽和硫酸銨溶液沉淀；(3)離子交換層析樣品制備：用陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖液重懸沉淀，制得上樣樣品；(4)陽離子交換層析柱純化：所得上樣樣品經(jīng)陽離子交換層析柱純化，收集上樣穿透液體；(5)陰離子交換層析柱純化：NaCl分段洗脫，收集洗脫液，得到谷氨酸脫羧酶酶液。本發(fā)明公布的純化工藝中將陽離子交換柱層析柱與陰離子交換柱層析柱串聯(lián)，大大縮短純化時間，簡化樣品處理過程。利用本發(fā)明公布的方法所得谷氨酸脫羧酶回收率約為60％，純化倍數(shù)為20左右。
【專利說明】一種分離純化谷氨酸脫羧酶的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從微生物中分離純化谷氨酸脫羧酶的方法，尤其涉及一種利用層析技 術(shù)從宿主菌中分離純化谷氨酸脫羧酶的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] γ -氨基丁酸（GABA)存在于哺乳動物腦、脊髓中，是一種抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)，由 谷氨酸脫羧酶（GAD)催化谷氨酸得到。GABA具有調(diào)節(jié)血壓與心律、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、促進精神 安定、促進腦部供血、促進長期記憶、促進激素分泌、腎功能活化等作用。
[0003] γ -氨基丁酸的生產(chǎn)基本采用化學(xué)合成、植物富集法和生物合成法。其中化學(xué)合成 成本高且因使用有毒試劑，存在安全性差，且反應(yīng)中間產(chǎn)物多，產(chǎn)物純度難保證。生物合成 法下游分離純化難度高且難獲得谷氨酸脫羧酶活性高的微生物菌株。植物富集法含量低， 反應(yīng)液天然成分復(fù)雜，同樣存在純化問題。
[0004] 篩選具有相對高活力的谷氨酸脫羧酶的微生物并擴大培養(yǎng)使其過量或高表達(dá)谷 氨酸脫羧酶，進而催化谷氨酸底物生成γ -氨基丁酸，即酶催化方法逐漸受到研宄者的親 睞，用于生產(chǎn)γ-氨基丁酸。
[0005] 目前報道的谷氨酸脫羧酶的分離純化方法比如常規(guī)的鹽析法、離子交換法、凝膠 色譜法等多用于進行谷氨酸脫羧酶的酶學(xué)性質(zhì)研宄，不追求回收率和比活，且純化工藝未 經(jīng)優(yōu)化，存在工藝復(fù)雜、生產(chǎn)周期長等問題，導(dǎo)致所得酶產(chǎn)品難以商業(yè)化。因此，改進現(xiàn)有生 產(chǎn)技術(shù)以生產(chǎn)高純度高比活的谷氨酸脫羧酶是非常有必要的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種利用層析技術(shù)從微生物中分離純化谷氨酸脫羧酶的方 法，該方法利用常規(guī)鹽析法、離子交換法等技術(shù)，合理設(shè)計純化路線并優(yōu)化得到。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種利用層析技術(shù)從微生物中分離純化谷氨酸脫羧酶的方法，包括如下步驟：（1) 菌體破碎：將表達(dá)谷氨酸脫羧酶的微生物細(xì)胞培養(yǎng)離心，制得濕菌體細(xì)胞，將所得濕菌體 細(xì)胞在-20°c反復(fù)凍融1-3次，加入菌體裂解緩沖液、溶菌酶，冰浴30-60min，加入聚乙二醇 辛基苯基醚，冰浴10_30min，離心取上清，制得菌體破碎液；（2)鹽析：向所得菌體破碎液加 入2倍飽和硫酸銨溶液，4°C靜置過夜，10000rpm4°C離心30min，收集沉淀；（3)制備離子交 換層析上樣樣品：用陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖液重懸沉淀，制得上樣樣品；(4)陽離子交 換層析柱純化：所得上樣樣品經(jīng)陽離子交換層析柱純化，其中結(jié)合緩沖液PH高于谷氨酸脫 羧酶等電點，收集上樣穿透液體；(5)陰離子交換層析柱純化：穿透液體經(jīng)陰離子交換柱層 析柱純化，NaCl分段洗脫，收集洗脫液，得到谷氨酸脫羧酶酶。
[0009] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述菌體裂解緩沖液配方為50mM PB，pH6. 0、500mM NaCl、lmM 二硫蘇糖醇。
[0010] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度為0. 1%。
[0011] 優(yōu)選的，步驟（1)中所述溶菌酶的終濃度為〇. 2mg/mL。
[0012] 優(yōu)選的，步驟（3)中所述陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖液為50mM磷酸緩沖液， pH6. 0, ImM二硫蘇糖醇，2mM乙二胺四乙酸鈉，0. 1 %聚乙二醇辛基苯基醚，5 %甘油，50mM NaCl0
[0013] 優(yōu)選的，步驟（4)中所述陰離子交換柱層析柱結(jié)合緩沖液為50mM磷酸緩沖液， pH6. 0, ImM二硫蘇糖醇，2mM乙二胺四乙酸鈉，0. 1 %聚乙二醇辛基苯基醚，5 %甘油，50mM NaCl，步驟（4)所得的穿透液體直接作為陰離子交換柱層析柱的上樣樣品。
[0014] 優(yōu)選的，步驟（5)所述的谷氨酸脫羧酶酶液經(jīng)超濾膜過濾濃縮或透析袋透析濃 縮，收集濃縮液，制得谷氨酸脫羧酶。
[0015] 更進一步的，根據(jù)本發(fā)明所述的方法得到的谷氨酸脫羧酶于_20°C或_80°C低溫 保存，
[0016] 更進一步的，將根據(jù)本發(fā)明所述的方法得到的谷氨酸脫羧酶冷凍干燥，低于4°C保 存。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：1、利用谷氨酸脫羧酶的等電點pH約在5. 0左右，設(shè)計陰陽 離子交換柱層析，使二者的緩沖體系相同，陽離子交換柱層析的穿透液體可直接作為后續(xù) 陰離子層析柱的上樣樣品，因此可將陽離子交換柱層析柱與陰離子交換柱層析柱串聯(lián)，大 大縮短純化時間，簡化樣品處理過程；2、采用低溫反復(fù)凍融破碎和溶菌破碎具體菌體，破碎 徹底，提高谷氨酸脫羧酶產(chǎn)量。

【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限如此。
[0019] 實施例一
[0020] 谷氨酸脫羧酶酶活測定方法
[0021] 采用比色法測定。
[0022] 1個GAD活力單位（U)定義為：在37°C，pH5. 5條件下，每分鐘每毫升酶液中催化 谷氨酸脫羧酶發(fā)生脫羧反應(yīng)生成1 μ mol的GABA所需酶量。
[0023] 純化倍數(shù)為純化所得酶液比活力與菌體破碎液比活力的比值。
[0024] 回收率為（純化所得酶液活力*體積）與（菌體破碎液活力*體積）的比值。
[0025] 實施例二
[0026] 谷氨酸脫羧酶純化方法
[0027] 菌體裂解緩沖液配方：50mM PB，pH6. 0、500mM NaClUmM二硫蘇糖醇。
[0028] 聚乙二醇辛基苯基醚母液濃度：10%。
[0029] 溶菌酶母液濃度：5mg/mL。
[0030] 陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖液配方：50mM磷酸緩沖液，pH6. 0, ImM二硫蘇糖醇， 2mM乙二胺四乙酸鈉，0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚，5%甘油，50mM NaCl。
[0031] 陰離子交換層析柱結(jié)合緩沖液配方：50mM磷酸緩沖液，pH6. 0, ImM二硫蘇糖醇， 2mM乙二胺四乙酸鈉，0. 1%聚乙二醇辛基苯基醚，5%甘油，50mM NaCl。
[0032] 表達(dá)谷氨酸脫羧酶的菌種為大腸桿菌埃希氏菌CICC2190,購自中國工業(yè)微生物菌 種保藏管理中心（CICC)。
[0033] 菌種培養(yǎng)方法見專利CN201310244021。
[0034] 陽離子層析柱為：SP-Sepharose fast flow
[0035] 陰離子層析柱為：Q-Sepharose fast flow
[0036] 離子層析柱為：純化步驟：
[0037] (1)將IOOOmL表達(dá)谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌埃希氏菌菌體培養(yǎng)液4000rpm/min 離心30min，制得濕菌體細(xì)胞，將所得濕菌體細(xì)胞在-20°C反復(fù)凍融3次，加入IOOmL菌體裂 解緩沖液，4mL溶菌酶母液，冰浴60min，加入0. ImL聚乙二醇辛基苯基醚，冰浴10-30min， 10000rpm/min離心30min取上清，制得菌體破碎液；
[0038] (2)鹽析：向所得菌體破碎液攪拌緩慢加入200mL預(yù)冷的飽和硫酸銨溶液，4°C靜 置過夜，IOOOOrpm 4°C離心30min，收集沉淀；
[0039] (3)制備離子交換層析上樣樣品：用IOOmL陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖液重懸沉 淀，制得陽離子交換層析柱上樣樣品；
[0040] (4)安裝陽離子交換層析柱，柱規(guī)格I. 6cmX 20cm，柱體積IOml ;用10倍柱體積的 去離子水洗絳，5倍柱體積的陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖洗絳；2mL/min流速上樣，收集穿 透液；
[0041] (5)安裝陰離子交換層析柱，柱規(guī)格I. 6cmX 20cm，柱體積IOml ;用10倍柱體積的 去離子水洗滌，5倍柱體積的陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖洗滌；
[0042] 2mL/min流速上樣；5倍柱體積的陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖洗絳；100mM、200mM、 300mM、400mM、500mM NaCl分段洗脫，分別收集洗脫液；
[0043] (6)GAD活性檢測，收集GAD酶液_20°C低溫保存。
[0044] SDS-PAGE純度檢測，Bradford蛋白定量，比色法測定GAD活性。
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用層析技術(shù)從微生物中分離純化谷氨酸脫羧酶的方法，包括如下步驟： 步驟（1)菌體破碎：將表達(dá)谷氨酸脫羧酶的微生物細(xì)胞培養(yǎng)離心，制得濕菌體細(xì)胞，將 所得濕菌體細(xì)胞在_20°C反復(fù)凍融1-3次，加入菌體裂解緩沖液、溶菌酶，冰浴30-60min，加 入聚乙二醇辛基苯基醚，冰浴10-30min，離心取上清，制得菌體破碎液； 步驟⑵鹽析：向所得菌體破碎液加入2倍飽和硫酸銨溶液，4°C靜置過夜， 10000rpm4°C離心30min，收集沉淀； 步驟（3)離子交換層析樣品制備：用陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖液重懸沉淀，制得上 樣樣品； 步驟（4)陽離子交換層析柱純化：所得上樣樣品經(jīng)陽離子交換層析柱純化，其中結(jié)合 緩沖液pH高于谷氨酸脫羧酶等電點，收集上樣穿透液體； 步驟（5)陰離子交換層析柱純化：所得穿透液體經(jīng)陰離子交換柱層析柱純化，NaCl分 段洗脫，收集洗脫液，得到谷氨酸脫羧酶酶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌體裂解緩沖液為50mM磷酸鹽緩沖 液 pH6. 0、500mM NaCl、lmM 二硫蘇糖醇。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇辛基苯基醚的終濃度為 0? 1%〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶菌酶的終濃度為0. 2mg/mL。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述陽離子交換層析柱結(jié)合緩沖液為 50mM磷酸緩沖液，pH6. 0，lmM二硫蘇糖醇，2mM乙二胺四乙酸鈉0. 1%，聚乙二醇辛基苯基 醚，5%甘油，50禮恥(：1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，陰離子交換柱層析柱結(jié)合緩沖液為50mM 磷酸緩沖液，PH6. 0, ImM二硫蘇糖醇，2mM乙二胺四乙酸鈉0. 1 %，聚乙二醇辛基苯基醚，5% 甘油，50mMNaCl，步驟（4)所得的穿透液體直接作為陰離子交換柱層析柱的上樣樣品。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法得到的谷氨酸脫羧酶酶液經(jīng)超濾膜過濾濃縮或透析袋 透析濃縮，收集濃縮液，制得谷氨酸脫羧酶。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的谷氨酸脫羧酶，其特征在于谷氨酸脫羧酶于-20°C或-80°C低 溫保存，或?qū)⑺霉劝彼崦擊让咐鋬龈稍?，低?°C保存。
【文檔編號】C12N9/88GK104480094SQ201410708189
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】金京勛 申請人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司