快速診斷川崎病的核酸標(biāo)記物及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了快速診斷川崎病的核酸標(biāo)記物及其試劑盒，該核酸標(biāo)記物為4種miRNAs，所述試劑盒中含有針對(duì)這4種miRNAs進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)的引物；診斷川崎病就只需定量分析血清中exosome里的這4種miRNA含量，然后對(duì)這4種miRNA的Ct值進(jìn)行特定的分析即可。本發(fā)明具有取材方便、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、時(shí)間花費(fèi)少、快速準(zhǔn)確、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能及時(shí)、快速、客觀、準(zhǔn)確診斷川崎病患兒，尤其是通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)即可將川崎病與常見(jiàn)易混淆癥狀的病毒感染分開(kāi)，有傳統(tǒng)診斷方法所不具備的優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明對(duì)川崎病患兒的快速診斷具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研制出在川崎病患兒上使用的快速診斷試劑盒提供了方向性。
【專利說(shuō)明】快速診斷川崎病的核酸標(biāo)記物及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速診斷川崎病的核酸標(biāo)記物及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 川崎?。↘awasaki disease KD)是一種病因不明的急性發(fā)熱性全身性血管炎綜 合征，該病最早于1961年由日本學(xué)者Tomisaku Kawasaki在日本首次發(fā)現(xiàn)，并于1967年首 先報(bào)道。自1970年以來(lái)，KD在世界絕大多數(shù)國(guó)家或地區(qū)被陸續(xù)報(bào)道，以亞裔人發(fā)病率為最 高。近年來(lái)KD己成為小兒常見(jiàn)病之一，KD主要影響5歲以下嬰幼兒，臨床特征為發(fā)熱、黏 膜炎、皮疹、頸淋巴結(jié)腫大和肢端改變，病理變化主要為全身性中小動(dòng)脈血管炎，尤其易造 成冠狀動(dòng)脈炎性損傷及其所引起的血栓性梗塞、狹窄、擴(kuò)張和動(dòng)脈瘤的形成。其中有些患兒 形成巨大冠狀動(dòng)脈瘤，巨大冠狀動(dòng)脈瘤長(zhǎng)期存在，后期發(fā)展為冠狀動(dòng)脈狹窄與閉塞，導(dǎo)致缺 血性心臟病，甚至引起死亡。此外，該病還可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、局灶性心肌缺血，心肌纖 維化及成人期的心肌梗死，重者可導(dǎo)致猝死。即使對(duì)形成冠狀動(dòng)脈瘤的KD患者進(jìn)行了及時(shí) 有效的針對(duì)性治療，但仍有患者因形成巨大冠狀動(dòng)脈瘤造成死亡。有文獻(xiàn)表明，冠狀動(dòng)脈擴(kuò) 張的發(fā)生率為18. 6%?26. 0%，冠狀動(dòng)脈瘤發(fā)生率為3. 1%?5. 2%，而且，冠狀動(dòng)脈瘤的發(fā)生 率呈逐年上升趨勢(shì)。冠狀動(dòng)脈瘤是KD最嚴(yán)重的并發(fā)癥，冠狀動(dòng)脈瘤發(fā)生時(shí)血管內(nèi)膜易形成 血栓、血管內(nèi)皮增生，造成臨近冠狀動(dòng)脈管腔的狹窄。瘤內(nèi)血液滯留，易形成血栓，從而導(dǎo)致 鄰近冠狀動(dòng)脈血流量減少，發(fā)生心肌梗死及猝死。若瘤的直徑>8 mm，則成為巨大瘤，消退 就更加困難，且發(fā)生狹窄的幾率隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加。給患兒帶來(lái)很大的風(fēng)險(xiǎn)并嚴(yán)重的 影響了患兒的生活質(zhì)量。而目前針對(duì)KD致冠狀動(dòng)脈瘤的主要治療手段包括：長(zhǎng)期抗凝治 療、溶栓治療、外科冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、心臟移植以及介入治療，但都屬于事后補(bǔ)救性的治療 措施，效果均不理想，除治療費(fèi)用昂貴外，治療后患兒的生存質(zhì)量亦無(wú)法保證。
[0003] 報(bào)道顯示，在日本和美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家或地區(qū)，KD所致的冠狀動(dòng)脈并發(fā)癥已取代風(fēng) 濕熱成為兒童獲得性心臟病的第一位病因，并且成為成人后缺血性心臟病的主導(dǎo)因素之 一。在我國(guó)，KD的發(fā)病率也很高，成為僅次于日本、韓國(guó)之后的第三大高發(fā)國(guó)，并且也已經(jīng) 取代風(fēng)濕熱成為我國(guó)小兒后天性心臟病最主要的病因，近年來(lái)亦呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，給 我國(guó)兒童的心臟及血管健康帶來(lái)很大的風(fēng)險(xiǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。
[0004] 目前對(duì)KD的診斷包括臨床指征、超聲影像和實(shí)驗(yàn)室檢查。臨床上診斷KD，主要依 照患兒的臨床表現(xiàn)，待一系列典型體征出現(xiàn)后，并排除其他可能的疾病，方能診斷，時(shí)效性 不佳。超聲影像學(xué)檢查方面，主要借助于超聲心動(dòng)圖確診冠狀動(dòng)脈病變，而對(duì)于KD患兒早 期輕微冠狀動(dòng)脈病變，超聲診斷則存在局限性。實(shí)驗(yàn)室檢查主要采用全身炎性指標(biāo)來(lái)輔助 診斷小兒KD :急性期外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞增高、輕度貧血、血小板進(jìn)行性增高、C反 應(yīng)蛋白明顯增加及紅細(xì)胞沉降率明顯增快等。由于這些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)是通過(guò)炎性指標(biāo)來(lái)間接 輔助診斷KD，故特異性和指向性均不理想。許多其他疾病尤其是感染性疾病也會(huì)產(chǎn)生全身 炎癥，故此傳統(tǒng)診斷方案常與其他感染性疾病相混淆，貽誤治療時(shí)機(jī)。
[0005] 近年來(lái)不典型KD臨床診斷較為困難，不典型KD發(fā)生率約為10%?36%，且發(fā)病率 逐年攀升，不典型KD臨床表現(xiàn)也常呈多樣性及復(fù)雜性，易誤診為呼吸道感染、敗血癥、藥物 疹、猩紅熱、麻疹、淋巴結(jié)炎、幼年型類風(fēng)濕等疾病，易由于誤診或漏診而錯(cuò)過(guò)最佳的治療時(shí) 間。因此，許多兒童在確診KD時(shí)，冠狀動(dòng)脈損傷就已經(jīng)形成了。
[0006] 近年來(lái)，學(xué)者們一直在努力尋找KD早期診斷的標(biāo)志物，因受KD病因和致病機(jī)制不 清楚的限制，學(xué)者們大多數(shù)是從基因，細(xì)胞因子，炎性因子等入手，找到的生物標(biāo)記物無(wú)法 用來(lái)作為特異性的指標(biāo)診斷KD，雖然，有些研究報(bào)道心肌型脂肪酸結(jié)合蛋白（h-FABP)、基 質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)、N端腦利鈉肽原（NT-pro BNP)等一些蛋白和基因有可能作為診斷 川崎病的分子標(biāo)記物，但其靈敏度和特異性難以同時(shí)滿足，且與檢驗(yàn)者的取材手法、操作水 平等相關(guān)，易造成誤差，因此都未能得到較大臨床隊(duì)列的證實(shí)。到目前為止，仍未有一個(gè)公 認(rèn)指標(biāo)和方法。因此，找到一種能快速準(zhǔn)確診斷川崎病的分子標(biāo)記物是非常重要的，能為臨 床治療指明方向，可以避免冠狀動(dòng)脈病變的發(fā)生，改善預(yù)后，提高川崎病患兒的生存質(zhì)量。
[0007] Exosome是活細(xì)胞分泌的來(lái)源于晚期核內(nèi)體（也稱為多囊泡體）的囊泡，當(dāng)多 囊泡體與質(zhì)膜融合就會(huì)把內(nèi)含的囊泡釋放到胞外。研究表明，來(lái)源于不同細(xì)胞的exosome 含有源細(xì)胞最關(guān)鍵的功能分子。Exosome是一種直徑為30?100 nm的小囊泡，可由多種 細(xì)胞分泌，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及微RNA等成分。不同細(xì)胞來(lái)源的exosome所含的蛋白質(zhì) 及微RNA不同，其生物學(xué)功能也有所差異，血液中的exosome是一種密度很低的固相成分， 被認(rèn)為攜帶有豐富的生物標(biāo)志物信息，因此，近年來(lái)受到普遍關(guān)注，在人體體液如血清、尿 液、組織液等中被exosome的膜所包裹的RNA不會(huì)被核酸酶降解，而且不受白蛋白，IgG等高 豐度蛋白的影響。由于來(lái)源于細(xì)胞，exosome所含的物質(zhì)表征著細(xì)胞中的部分物質(zhì)，也就給 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的某些蛋白質(zhì)與核酸的變化帶來(lái)了可能性。近年來(lái)，體液中的exosome在臨床 診斷中的意義日益被人們所重視，如癌癥患者的血清中存在的能作為早期診斷數(shù)種癌癥 的microRNA分子標(biāo)志物。此外，組學(xué)手段對(duì)病因未知的疾病尋找特異性分子標(biāo)記提供了 最佳的平臺(tái)和技術(shù)。目前常用的組學(xué)范疇有基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組等，可以用一定的實(shí)驗(yàn) 手段和數(shù)據(jù)分析方法研究樣品中DNA、RNA或蛋白質(zhì)的全體，通過(guò)對(duì)比來(lái)自正常個(gè)體和病人 的樣品數(shù)據(jù)，可望找到疾病特異性的分子標(biāo)記物，為疾病早期診斷、病因分析、后續(xù)深入研 究和治療等提供重要基礎(chǔ)。目前，這些方法已經(jīng)在研究細(xì)胞的增殖、分化、異常轉(zhuǎn)化、腫瘤形 成等方面進(jìn)行了有力的探索，涉及到肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、腎癌和 神經(jīng)母細(xì)胞瘤等，鑒定了一批腫瘤相關(guān)蛋白，為腫瘤的早期診斷、藥靶的發(fā)現(xiàn)、療效判斷和 預(yù)后提供了重要依據(jù)。某些核酸分子亦可作為疾病診斷的分子標(biāo)志物，臨床診斷實(shí)踐中， 檢測(cè)核酸標(biāo)記物具有靈敏度高、特異性好、可精確定量的特點(diǎn)，很適合作為早期診斷的標(biāo)志 物。
[0008] 成熟microRNA (miRNA)是一類長(zhǎng)約17?25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，主要 通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（UTR)、5'-UTR和編碼區(qū)域的堿基互補(bǔ)配對(duì)抑制靶mRNA翻 譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)。生物信息學(xué)研究表明，每一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基 因，反之，1個(gè)靶基因也可以同時(shí)被多個(gè)miRNAs調(diào)節(jié)。因此，據(jù)保守估計(jì)，約60%? 70%的人類蛋白編碼基因受到miRNAs的調(diào)控，單個(gè)miRNA分子能夠與數(shù)百個(gè)功能各異 的靶mRNA相結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，參與了哺乳動(dòng)物幾乎所有的病理和生理活動(dòng)，如個(gè)體發(fā) 育、組織分化、細(xì)胞凋亡以及能量代謝等，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展存在著緊密的聯(lián)系。
[0009] 既往對(duì)miRNAs的研究主要集中于它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的活動(dòng)。2008年，Mitchell等通 過(guò)分離健康人血漿中的18?24個(gè)核苷酸的RNA，構(gòu)建了小RNA文庫(kù)，對(duì)得到的125個(gè)DNA 克隆進(jìn)行測(cè)序分析，在所采用的血楽樣本中克隆到包括let-7a、miR-16和miR-15b等在內(nèi) 的37種miRNA分子，并發(fā)現(xiàn)miRNAs能以一種非常穩(wěn)定的形式存在于人體血楽中，以保護(hù)其 免受內(nèi)源性RNase的降解。同一時(shí)間，Chen等通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)血清中miRNA進(jìn)行 了分析，在男、女性健康人血清中分別發(fā)現(xiàn)了超過(guò)100和91種血清miRNA，且在惡劣的條件 下(如高溫、極低或極高的pH環(huán)境、多次凍融)仍能保持穩(wěn)定，而此時(shí)大多數(shù)RNA都會(huì)降解。 此外，對(duì)正常人和不同疾病患者血清/血漿中miRNA檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA廣泛存在于正常 人和患者的血清/血漿中，并且隨著生理狀況、疾病種類和病程的不同，miRNA的表達(dá)譜將 發(fā)生特異性變化。最近有研究表明，不同的腫瘤顯示出特異性的microRNA表達(dá)譜，腫瘤來(lái) 源的microRNA能被釋放到循環(huán)系統(tǒng)中，進(jìn)入血液組織。而在血液組織中，microRNA能避免 被RNase降解，具有良好的穩(wěn)定性。因此，血清血漿中的microRNA有成為腫瘤生物標(biāo)志物 的潛力。例如，最近的研究發(fā)現(xiàn)在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中miR-21的含量比正 常人群高。由于研究發(fā)現(xiàn)在人類血清血楽中存在大量穩(wěn)定的microRNA。血液中的Exosome 被認(rèn)為攜帶有豐富的生物標(biāo)記物信息，來(lái)源于不同細(xì)胞的exosome含有源細(xì)胞最關(guān)鍵的功 能分子，因此，近年來(lái)，體液中的exosome在臨床診斷中的意義日益被人們所重視。如癌癥 患者的血清中存在的能作為早期診斷數(shù)種癌癥的microRNA分子標(biāo)志物，這些現(xiàn)象表明，我 們可以尋找川崎病患者血清e(cuò)xosome中表達(dá)量發(fā)生明顯改變的microRNA,以此作為生物標(biāo) 記物進(jìn)行川崎病的早期診斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速診斷川崎病的核酸標(biāo)記物。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種快速診斷川崎病的試劑盒。
[0012] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 小分子 RNA miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 聯(lián)合作為川崎病快速 檢測(cè)的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0013]優(yōu)選的，上述小分子 RNA miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 為 血清中 Exosome 小體內(nèi)的 miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197_3p 和 miR-671_5p。
[0014] -種快速診斷川崎病的試劑盒，該試劑盒含有對(duì)血清中Exosome小體內(nèi) miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑。
[0015] 優(yōu)選的，上述試劑盒中含有針對(duì)miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和 miR-671-5p進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)的引物SEQ ID N0:9?16。
[0016] 優(yōu)選的，上述試劑盒中含有針對(duì)miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和 miR-671-5p 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的引物 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是： 1)相對(duì)于傳統(tǒng)川崎病的診斷如臨床指征、超聲影像和實(shí)驗(yàn)室檢查等，本發(fā)明具有取材 方便、操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、時(shí)間花費(fèi)少、快速準(zhǔn)確、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能及時(shí)、快速、客觀、準(zhǔn) 確診斷川崎病患兒，尤其是可以通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)將川崎病與常見(jiàn)易混淆癥狀的病毒感染分 開(kāi)，有傳統(tǒng)診斷方法所不具備的優(yōu)勢(shì)。因此，本發(fā)明對(duì)于川崎病患兒的快速診斷具有極大的 臨床應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步研制出在川崎病患兒上使用的快速診斷試劑盒提供了方向性。
[0018] 2)本發(fā)明檢測(cè)血漿/血清中的穩(wěn)定的miRNA，而傳統(tǒng)潛在分子診斷方案檢測(cè)蛋白 質(zhì)，在定量測(cè)定方面，miRNA的定量精度和靈敏度非常高，使用qPCR技術(shù)甚至可以達(dá)到單分 子檢測(cè)的能力；而傳統(tǒng)方法檢測(cè)蛋白質(zhì)，靈敏度較低，且定量精度較差。
[0019] 3)傳統(tǒng)潛在分子診斷方案是測(cè)定某蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，與參考范圍或標(biāo)準(zhǔn)品相比 來(lái)得出檢測(cè)結(jié)論。但絕對(duì)含量勢(shì)必因?yàn)槿臃椒?、提取效率、操作人員實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)度等問(wèn)題而 產(chǎn)生偏差，影響檢驗(yàn)的效果。本發(fā)明采用多個(gè)miRNA而并非單一指標(biāo)來(lái)進(jìn)行檢驗(yàn)，比檢測(cè)單 一指標(biāo)的可靠性高很多。而且本發(fā)明的檢驗(yàn)方案是使用樣品中幾種miRNA進(jìn)行自對(duì)照，完 全消除了因?yàn)槿臃椒ā⑻崛⌒?、操作人員操作熟練程度等因素帶來(lái)的誤差，因而穩(wěn)健性 比傳統(tǒng)方法好很多，便于低成本大規(guī)模推廣應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為健康孩子（Control)與KD患兒血清中exosome的特征：（A)透射電鏡下 所見(jiàn)健康孩子與KD患兒血清中exosome的形態(tài)特征；（B)電鏡觀察健康孩子與KD患兒血 清中200個(gè)exosome的直徑分布范圍；（C)與血清（serum, S)相比，exosome(Ex)中三個(gè)標(biāo) 志性蛋白CD9, CD81和TSG101的含量檢測(cè)（western blot); 圖2為5個(gè)健康孩子等量血清混合與5個(gè)KD患兒等量血清中exosome里microRNA Microarray分析結(jié)果，僅列出上調(diào)或下調(diào)表達(dá)差異在200倍以上的miRNA，KD為KD患者， Control為正常者； 圖3為5個(gè)合胞病毒感染患兒、5個(gè)腺病毒感染患兒與20個(gè)KD患兒和20個(gè)健康孩子 血清中exosome里對(duì)microRNA Microarray結(jié)果進(jìn)行突光定量PCR驗(yàn)證，兩兩互作參照的 t檢驗(yàn)結(jié)果；(A) KD組與正常組對(duì)比；(B)正常組與合胞病毒（RSV)感染組對(duì)比；（C)正常 組與腺病毒（ADV)感染組對(duì)比； 圖4為檢測(cè)效果的檢驗(yàn)；采用熒光定量PCR方法檢測(cè)8個(gè)合胞病毒感染患兒、2個(gè)腺病 毒感染患兒和2個(gè)EB病毒感染患兒與30個(gè)KD患兒和30個(gè)健康孩子血清中exosome里 4 種 microRNAs 的含量，并以 Ct (miR-1246) -Ct (miR-4436b-5p)差值和 Ct (miR-197-3p) -Ct(miR-671-5p)差值為兩個(gè)軸向進(jìn)行二維作圖。黑點(diǎn)為健康孩子的數(shù)據(jù)，紅叉為KD患兒 數(shù)據(jù)，藍(lán)色標(biāo)記為各種病毒感染患兒的數(shù)據(jù)。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明。 應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明 具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所 建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0022] 在本發(fā)明中，KD患兒血清中exosome里的miR-1246表達(dá)量與miR-4436b_5p表 達(dá)量的差值，及miR-197-3p表達(dá)量與miR-671-5p表達(dá)量的差值，與健康孩子相比，均發(fā)生 了明顯的改變，而且樣本量越大，這種改變的趨勢(shì)越明顯，此外，由于川崎病最主要的癥狀 是持續(xù)發(fā)燒，且體溫超過(guò)39°C，所以為了能與其他發(fā)熱性疾病區(qū)分開(kāi)來(lái)，我們又把這兩對(duì) miRNAs在發(fā)熱性疾病(合胞病毒感染、腺病毒和EB病毒感染)患兒進(jìn)行了特異性篩查，實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明這兩對(duì)miRNAs與發(fā)熱性疾病的這兩對(duì)miRNAs能明顯區(qū)分，即說(shuō)明這兩對(duì)miRNAs : miR-1246與miR-4436b-5p，及miR-197-3p與miR-671-5p是川崎病特異性的分子標(biāo)記物， 通過(guò)分析血清中 Exosome 里 Ct(miR-1246)-Ct(miR-4436b_5p)差值和 Ct(miR-197_3p)-Ct (miR-671-5p)的差值情況，能快速準(zhǔn)確診斷KD患兒，能將KD患兒與其他發(fā)熱性疾病區(qū)分 開(kāi)來(lái)，這對(duì)KD患者的早期診斷具有顯著的意義。
[0023] 實(shí)施例1:快速診斷川崎病核酸標(biāo)記物的篩選 一、 初篩 (1) 分別采集健康孩子和KD患兒血液500W，4°C冰箱靜置1-2 h，2000 rpm離心5 min 后，取出血清； (2) 按照 exosome 提取試劑盒（System Biosciences Inc, Mountain View, CA)說(shuō)明，提 取血清中的Exosome ; (3) 在透射電鏡下觀察exosome的形態(tài)，確認(rèn)其直徑都在30-100nm之間（如圖1A和圖 1B所示）。此外，用western Blot檢測(cè)exosome的三個(gè)標(biāo)志性蛋白CD9, CD81和TSG101的 表達(dá)如圖 1C所不（Stamer WD, Hoffman EA, Luther JM, Hachey DL,,Schey K.L: Protein profile of exosomes from trabecular meshwork cells. J Proteomics 2011,74 (6): 796-804 和 Street JM, Barran PE, Mackay CL, ffeidt S, Balmforth C, Walsh TS, Chalmers RT, Webb DJ, Dear Jff: Identification and proteomic profiling of exosomes in human cerebrospinal fluid. J Transl Med 2012, 5;10:5. doi: 10.1186/1479-5876-10-5)； (4) 用Trizol試劑（Life Tech Inc, USA)提取exosome里的RNA,并對(duì)其進(jìn)行濃度和 純度的測(cè)定； (5) 核酸標(biāo)記物的初篩：通過(guò)上述分析方法，把5個(gè)健康孩子和5個(gè)川崎病患兒的等量 混合血清中Exosome里的RNA進(jìn)行microRNA Microarray分析，按照上調(diào)或下調(diào)表達(dá)差異> 200倍的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了 microRNA的初篩，通過(guò)microRNA Microarray分析得到上調(diào)或下調(diào)表 達(dá)差異明顯的 miRNAs (差異> 200 倍），其中包括了 miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和miR-671_5p (見(jiàn)圖2)，該4種miRNA的核酸序列如表1所示。
[0024]表 1 miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 的核酸序列

【權(quán)利要求】
1. 小分子 RNA miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 聯(lián)合作為川崎病 快速檢測(cè)的生物標(biāo)記物的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述的小分子RNA miR-1246、 miR-4436b_5p、miR-197_3p 和 miR-671_5p 為血清中 Exosome 小體內(nèi)的 miR-1246、 miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p。
3. -種快速診斷川崎病的試劑盒，其特征在于：該試劑盒含有對(duì)血清中Exosome小體 內(nèi) miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 表達(dá)量進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速診斷川崎病的試劑盒，其特征在于：該試劑盒中含 有針對(duì) miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測(cè)的引 物 SEQ ID NO:9?16。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種快速診斷川崎病的試劑盒，其特征在于：該試劑盒中含 有針對(duì) miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p 和 miR-671-5p 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的引物 SEQ ID N0:5、 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450901SQ201410709423
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】賈紅玲, 張弓, 劉超武, 張麗, 陳杰, 曾宏彬, 余旻斐 申請(qǐng)人:廣州賽哲生物科技有限公司