一種多胎羊的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多胎羊的檢測方法，具體步驟為：DNA的提取；引物和探針的設(shè)計；PCR-LDR反應(yīng)；取1μLLDR連接產(chǎn)物與1μLABIGS500ROX熒光標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)和1μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2min，冰中驟冷，于含有5mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝膠中電泳2.5h，進行數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小測量和校正內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)，進行數(shù)據(jù)分析和基因分型。本發(fā)明利用連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)，以堿基錯配為基礎(chǔ)，使用特異性引物和探針對特定片段DNA進行識別，具有準(zhǔn)確度高、通用性強、通量大、操作簡單、成本低等優(yōu)點。
【專利說明】一種多胎羊的檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種多胎羊的檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 綿羊育種主要是改善其生長和繁殖性狀。迄今為止已發(fā)現(xiàn)了一些控制這些生長和 繁殖性狀的基因，比如，BMPR-IB、BMP15和⑶F9已被確認(rèn)為綿羊的高繁殖力主效基因；黑素 皮質(zhì)素受體-4 (melanocortin-4receptor，MC4R)是一類G-蛋白偶聯(lián)受體，主要在下丘腦表 達，在體重、能量平穩(wěn)和采食量的調(diào)控中發(fā)揮重要作用；鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin， CAST)是鈣蛋白酶系統(tǒng)的主要成員之一，它是鈣激活蛋白酶的抑制因子，可以通過激活鈣蛋 白酶或降低鈣蛋白酶抑制蛋白的活性來提高肌肉的嫩度，改善肉質(zhì)。
[0003] 隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)可以快速提高一些單胎 品種雙胎率，或者提高其胎產(chǎn)羔數(shù)，從而大幅度提高其繁殖力。分子標(biāo)記輔助選擇是通過分 子生物學(xué)技術(shù)直接分析DNA分子的一些突變位點，可以準(zhǔn)確判斷基因型，而且不受時間的 限制，可以做到早期選擇。
[0004] 目前檢測DNA突變位點的方法一般采用限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)和單鏈構(gòu)象 多態(tài)性技術(shù)，這兩種方法依靠肉眼進行結(jié)果的觀察，有時會出現(xiàn)判斷錯誤，從而影響檢測結(jié) 果的可靠性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種多胎羊的檢測方法，利用連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)及生物 信息學(xué)技術(shù)，檢測綿羊繁殖候選基因在綿羊中的多態(tài)性，從而判斷出多胎羊。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] -種多胎羊的檢測方法，具體步驟如下：
[0008] (I) DNA的提?。簭难虻念i靜脈采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混勻后-20°C凍存后， 采用細(xì)胞裂解和蛋白去除液從凍存的抗凝全血中得到基因組DNA ;
[0009] (2)引物和探針的設(shè)計：根據(jù)基因序列設(shè)計引物，同時根據(jù)LDR探針設(shè)計原則設(shè)計 探針；
[0010] (3) PCR-LDR反應(yīng)，分為PCR反應(yīng)和LDR反應(yīng)；
[0011] (4)數(shù)據(jù)分析和基因分型：取IyL LDR連接產(chǎn)物與IyL ABI GS 500 ROX熒光 標(biāo)記分子量標(biāo)準(zhǔn)和1 μ L去離子甲酰胺上樣液混合，95°C加熱變性2min，冰中驟冷，于含有 5mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝膠中電泳2. 5h，進行數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小 測量和校正內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)；進行數(shù)據(jù)分析和基因分型。
[0012] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述步驟（1)還包括采用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢 測基因組DNA的完整性。
[0013] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述PCR反應(yīng)包括以下小步驟：
[0014] 1)準(zhǔn)備 20uL 體系 PCR Master Mix
[0015] 在 I. 5ml 離心管中分別加入 10 X PCR-buffer200ul，IOOmM Mg2+60ul，20mM/each (11'011>20〇111，511/111139酶2〇111，4\(>)-8〇1111:;[011400111，5卩]\1。1'；[111640111，最后加入980111去 離子水，充分混勻后離心，再取19ul分裝在200ul的PCR反應(yīng)管中，最后再加入Iul基因組 DNA ；
[0016] 2)將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95°C變性15m，35個循環(huán)，每 個循環(huán)有3個溫度，94°C 30s，56°C lm，72°C lm，最后在72°C延伸7m;
[0017] 3)反應(yīng)結(jié)束后，取2 μ I反應(yīng)產(chǎn)物在3.0%瓊脂糖膠，0.5XTBE中電泳，檢測反應(yīng)是 否成功；
[0018] 4)剩余樣品保存于-20°C。
[0019] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述LDR反應(yīng)包括以下小步驟：
[0020] 1)準(zhǔn)備IOul體系連接反應(yīng)Mix
[0021] 在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入等體積ddH20稀釋，作為連接反應(yīng)的模板；
[0022] 2)在 I. 5ml 離心管中分別加入 lOXbufferlOOul，IOOul Probe Mix，5ul 連接酶， 695ul去離子水，充分混勻后離心，再取9ul分裝在200ul的PCR反應(yīng)管中，最后再加入 IulPCR反應(yīng)產(chǎn)物；
[0023] 3)將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進行連接反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95°C變性2m，35個循環(huán)， 每個循環(huán)有2個溫度，94°C 30s，50°C 2m。
[0024] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述基因序列包括但不限于BMPR-IB基因、BMP15基 因、⑶F9基因、MC4R基因和CAST基因。
[0025] 作為本發(fā)明進一步的方案：所述方法還包括卡方檢驗、遺傳參數(shù)和最小二乘方差 分析。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：利用連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)及生物信息學(xué) 技術(shù)，以堿基錯配為基礎(chǔ)，使用特異性探針對特定片段DNA進行識別，具有很高的準(zhǔn)確性； 同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低；具有準(zhǔn)確度高、通用性強、通量 大、操作簡單、成本低等優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1是全血基因組DNA抽提結(jié)果電泳圖；
[0028] 圖2是巴音布魯克羊多羔小群譜系圖；
[0029] 圖3是巴音布魯克羊單羔家系譜系圖；
[0030] 圖4是巴音布魯克羊BMPRlB基因 FecB突變位點的熒光-構(gòu)象敏感凝膠電泳圖；
[0031] 圖5是⑶F9基因 Gl突變位點的熒光-構(gòu)象敏感凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0032] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0033] -、主要儀器和設(shè)備：
[0034] PCR儀；PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 9600、MJ PTC-200Gradient Cycler， 愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)上海有限公司；
[0035] 測序儀；ABI PRISM 377DNA Sequencer、ABI PRISM 3100DNA Sequencer，愛普拜斯 應(yīng)用生物系統(tǒng)上海有限公司；
[0036] 電泳系統(tǒng)：電泳儀型號：JY600+，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；FR-200A全自 動紫外與可見分析裝置、生物電泳圖像分析系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；Agrose LE，上海 捷倍思基因技術(shù)有限公司；
[0037] 普通臺式離心機、電熱鼓風(fēng)干燥箱；Axygene PCR microplate 96well ;Axygene PCR tubes (0· 2mL) ;Eppendorf 移液器（各量程）。
[0038] 二、主要試劑：
[0039] AxyPr印-96全血基因組DNA試劑盒（AXYGEN，美國）；
[0040] PCR 系統(tǒng)：Qiagen hotstar Taq 酶體系（酶 5u/ul，buffer，Q-solution，Mg2+), Qiagen Hotstar,德國；dNTP(promega,2mM/each),Promega,美國；
[0041] LDR 系統(tǒng)：NEB Taq DNA Iigase 酶體系（酶 5u/ul，buffer)，NEB，英國；
[0042] 10M NaOH :取40gNa0H于滅RNase處理的燒杯，加入約70ml無 RNase的ddH20，充 分?jǐn)嚢枞芙?，定容到l〇〇ml，4°C保存；
[0043] IMTris-HCl (PH8. 0):取 12. IgTris 于滅 RNase 處理的燒杯，加入約 80ml 無 RNase 的ddH20,充分?jǐn)嚢枞芙?，濃鹽酸調(diào)PH8. 0,定容到100ml，4°C保存；
[0044] 0· 5M EDTA(PH8. 0):取 18. 61gEDTA 于滅 RNase 處理的燒杯，加入約 70ml 無 RNase 的ddH20,充分?jǐn)嚢枞芙?，?0M NaOH調(diào)PH8. 0,定容到100ml，4°C保存；
[0045] TE 緩沖液：IOmM Tris-HCl，ImM EDTA，pH8. 0,4°C保存；
[0046] 75%乙醇：取新開瓶無水乙醇75ml，加入經(jīng)過滅RNase處理的試劑瓶，加入 ddH2025ml，4°C 保存；
[0047] 5X上樣緩沖液：溴酚蘭0. 125g，32g甘油，滅菌水定容至50ml ;
[0048] EB (10mg/ml) :50mgEB，加 DEPC 水 5ml，分裝成 0· 5ml 的包裝，避光保存；
[0049] 5XTBE :Tris 54g，硼酸 27. 5g，20ml0. 5mol/L 的 EDTA(pH8. 0)，定容至 1000ml。
[0050] 三、檢測對象
[0051] 將新疆巴州和靜縣八棵樹鄉(xiāng)牧民的巴音布魯克羊多羔家系20只羊的親緣小群標(biāo) 記為群A，其譜系如圖2所示，雙羔率100%，將從新疆博湖縣巴州種畜場的一個300多只巴 音布魯克羊母羊群中隨機選出的100只成年母羊標(biāo)記為群B，其譜系如圖3所示，均產(chǎn)單羔； 從內(nèi)蒙古純種德美種羊場選擇2歲至7歲有產(chǎn)羔記錄的德國肉用美利奴羊成年母羊254只 (產(chǎn)羔記錄包括1-6胎的數(shù)據(jù)，雙羔率150% )、成年公羊27只；在新疆巴州和靜、焉耆、庫 爾勒三個多浪羊養(yǎng)殖戶中選擇有產(chǎn)羔記錄的多浪羊母羊83只（雙羔率170% )。
[0052] 實施例IBMPR-IB基因檢測
[0053] -種多胎羊的檢測方法，具體步驟如下：
[0054] (I) DNA的提?。簭难虻念i靜脈采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混勻后-20°C凍存后， 采用細(xì)胞裂解和蛋白去除液從凍存的抗凝全血中得到基因組DNA，采用0.8%的瓊脂糖凝 膠電泳檢測基因組DNA的完整性，如圖1所示；
[0055] (2)引物和探針的設(shè)計：根據(jù)綿羊BMPR-IB基因序列（AF ;312016)設(shè)計1對引物 檢測FecB突變，引物均采用Primer 5. O軟件進行設(shè)計，同時根據(jù)LDR探針設(shè)計原則設(shè)計探 針，PCR反應(yīng)引物序列及LDR反應(yīng)探針序列，如表1-表2所示。所有引物與探針均由上海 生工生物工程有限公司合成。
[0056] 表IPCR反應(yīng)引物序列 [00571

【權(quán)利要求】
1. 一種多胎羊的檢測方法，其特征在于，具體步驟如下： (1) DNA的提?。簭难虻念i靜脈采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混勻后-20°C凍存后，采 用細(xì)胞裂解和蛋白去除液從凍存的抗凝全血中得到基因組DNA ; (2) 引物和探針的設(shè)計：根據(jù)基因序列設(shè)計引物，同時根據(jù)LDR探針設(shè)計原則設(shè)計探 針； (3) PCR-LDR反應(yīng)，分為PCR反應(yīng)和LDR反應(yīng)； (4) 數(shù)據(jù)分析和基因分型：取ly L LDR連接產(chǎn)物與liiL ABI GS 500 ROX熒光標(biāo)記分 子量標(biāo)準(zhǔn)和1 U L去離子甲酰胺上樣液混合，95°C加熱變性2min，冰中驟冷，于含有5mol/L 尿素的5%聚丙烯酰胺凝膠中電泳2. 5h，進行數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小測量和 校正內(nèi)在分子量標(biāo)準(zhǔn)；進行數(shù)據(jù)分析和基因分型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述步驟（1)還包括采用 0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)包括以下小步 驟： 1) 準(zhǔn)備 20uL 體系 PCR Master Mix 在 1. 5ml 離心管中分別加入 10XPCR-buffer200ul，100mM Mg2+ 60ul，20mM/each dNTP 200ul，5U/ul Taq 酶 20ul，4XQ_solution400ul，5pM primer40ul，最后加入 980ul 去離子 水，充分混勻后離心，再取19ul分裝在200ul的PCR反應(yīng)管中，最后再加入lul基因組DNA ; 2) 將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進行反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95°C變性15m，35個循環(huán)，每個循 環(huán)有 3 個溫度，94°C 30s，56°C lm，72°C lm，最后在 72°C延伸 7m ; 3) 反應(yīng)結(jié)束后，取2 yl反應(yīng)產(chǎn)物在3. 0%瓊脂糖膠，0. 5 X TBE中電泳，檢測反應(yīng)是否成 功； 4) 剩余樣品保存于_20°C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述LDR反應(yīng)包括以下小步 驟： 1) 準(zhǔn)備10ul體系連接反應(yīng)Mix 在PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入等體積ddH20稀釋，作為連接反應(yīng)的模板； 2) 在 1. 5ml 離心管中分別加入 10 XbufferlOOul，100ul Probe Mix，5ul 連接酶，695ul 去離子水，充分混勻后離心，再取9ul分裝在200ul的PCR反應(yīng)管中，最后再加入lulPCR反 應(yīng)產(chǎn)物； 3) 將PCR反應(yīng)管放入PCR儀進行連接反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95°C變性2m，35個循環(huán)，每個 循環(huán)有2個溫度，94°C 30s，50°C 2m。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述基因序列包括但不限 于BMPR-IB基因、BMP15基因、⑶F9基因、MC4R基因和CAST基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多胎羊的檢測方法，其特征在于，所述方法還包括卡方檢驗、 遺傳參數(shù)和最小二乘方差分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328214SQ201410710810
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月29日
【發(fā)明者】左北瑤 申請人:新疆巴音郭楞蒙古自治州畜牧工作站