一種新型中溫α-淀粉酶的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新型中溫α-淀粉酶的應(yīng)用。氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示的α-淀粉酶AmyM在處理淀粉制備富含麥芽六糖糖漿方面的應(yīng)用。其中，所述的糖漿組分組成為：麥芽四糖以上低聚糖含量50％以上；麥芽三糖含量8-10％，麥芽糖含量低于6％，其他低聚糖低于35％。本發(fā)明淀粉酶制得的糖漿與現(xiàn)有的麥芽六糖糖漿相比，葡萄糖含量較低，麥芽六糖含量更高，酶處理后糖組分相對(duì)單一，應(yīng)用性更廣，且由于本發(fā)明涉及到的新型α-淀粉酶 AmyM的優(yōu)良特性，使得低聚糖的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，產(chǎn)物易純化。
【專利說(shuō)明】-種新型中溫α-淀粉酶的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于淀粉及淀粉糖制品制備技術(shù)、食品添加劑技術(shù)和含淀粉產(chǎn)品處理領(lǐng) 域，涉及一種新型中溫α-淀粉酶的應(yīng)用，具體涉及一種新型中溫α-淀粉酶在處理各種淀 粉制備富含麥芽六糖糖漿的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 低聚麥芽糖一般指由3 -9個(gè)單糖組成的聚合體，包含麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五 糖以及麥芽六糖等。低聚麥芽糖漿主要采用優(yōu)質(zhì)玉米淀粉，經(jīng)過(guò)淀粉酶水解而制得的糖漿， 產(chǎn)品甜度低，口感佳。經(jīng)過(guò)酶水解制備的低聚麥芽糖，食用后血糖上升緩慢，且發(fā)熱量低，對(duì) 于糖尿病、心血管患者以及肥胖者都有較好的保健作用。低聚麥芽糖引起的胰島素反應(yīng)平 穩(wěn)，克服了運(yùn)動(dòng)中服用單、雙糖引起的回躍性低血糖反應(yīng)，在運(yùn)動(dòng)飲料中具有重要的應(yīng)用前 景。生產(chǎn)高麥芽六糖含量糖漿由于所用的淀粉酶的性質(zhì)的原因，產(chǎn)量較低，目前市場(chǎng)上富含 麥芽六糖糖漿 7 y'才U 3' G67,其麥芽六糖/七糖總含量只有40%左右。而其他非產(chǎn)麥芽 六糖的α -淀粉酶制備的糖漿其麥芽低六糖含量一般低于30%。
[0003] 麥芽低聚糖（3-6糖）可以阻止面包存儲(chǔ)過(guò)程中支鏈淀粉的重結(jié)晶，改善面包品 質(zhì)。面包等面制品加工過(guò)程中淀粉顆粒在高溫下會(huì)發(fā)生糊化，在冷卻/存儲(chǔ)過(guò)程中其中的 支鏈淀粉會(huì)重新結(jié)晶，從而導(dǎo)致面包變硬，貨架期縮短。在面包等面制品中添加高產(chǎn)麥芽六 糖的中溫淀粉酶可以產(chǎn)生大量麥芽六糖等低聚麥芽糖，增加發(fā)酵率，改進(jìn)產(chǎn)品的體積和質(zhì) 地，改變面制品的口感，延長(zhǎng)面制品的保鮮時(shí)間。1955年美國(guó)FDA和英國(guó)1963年分別經(jīng)過(guò) "公認(rèn)無(wú)害"(General Recognized As Safe, GRAS)驗(yàn)證后，真菌淀粉酶允許作為面包添加劑 用于面包工業(yè)中。但真菌淀粉酶產(chǎn)物是麥芽糖，其抑制支鏈淀粉重結(jié)晶的效果較差。2009 年，來(lái)自于Pseudomonas saccharophila的麥芽四糖酶通過(guò)FDA的GRAS認(rèn)證，作為面包烤 制的添加劑被使用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)麥芽六糖的新型中溫淀粉酶由于其高產(chǎn)麥芽六糖活 性，具有作物面包烤制添加酶的潛力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新型中溫α-淀粉酶的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 本發(fā)明所述的α -淀粉酶AmyM為申請(qǐng)日為2013年2月4日，專利號(hào)為"ZL 201310043628. 5"名稱為"一種α-淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應(yīng)用" 的中國(guó)發(fā)明專利中請(qǐng)求保護(hù)的α -1，4淀粉酶外切酶。該淀粉酶的制備方法詳見(jiàn)"ZL 201310043628. 5"專利說(shuō)明書(shū)實(shí)施例1?2。
[0007] 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的α -淀粉酶AmyM在處理淀粉制備富含麥芽六 糖糖漿方面的應(yīng)用。
[0008] 其中，所述的糖漿組分組成為：麥芽四糖以上低聚糖含量50%以上；麥芽三糖含 量8-10%，麥芽糖含量低于6% (包括6%)，其他低聚糖低于35% (包括35%)，所述的麥 芽四糖以上低聚糖為4?7個(gè)單糖聚合形成的低聚糖；所述的其他低聚糖為八個(gè)及以上單 糖聚合形成的低聚糖。
[0009] 所述的糖漿中七糖及以下低聚糖的組成為：G1_葡萄糖3-5% ;G2_麥芽糖5-7% ; 63-麥芽三糖6-8%;64-麥芽四糖7-9%;65-麥芽五糖8-10%;66-麥芽六糖55-60% ; G7-麥芽七糖約4-6%。
[0010] 所述的淀粉的來(lái)源優(yōu)選玉米、小麥、土豆。
[0011] 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的α-淀粉酶AmyM酶解淀粉產(chǎn)物在制備運(yùn)動(dòng)飲 料、發(fā)酵飲料和/或啤酒發(fā)酵中的應(yīng)用。
[0012] 麥芽低聚糖可以在不改變食品的原味的情況下可達(dá)到食品低甜度化效果。其保 濕、吸濕性能穩(wěn)定能維持適當(dāng)?shù)乃?，防止烘烤制品中淀粉回生，維持食品的柔軟性、延長(zhǎng) 保質(zhì)期。本發(fā)明高產(chǎn)麥芽六糖的a-淀粉酶在制備低葡萄糖、高麥芽六糖含量糖漿方面具 有較好的應(yīng)用價(jià)值，并且可以作為添加劑來(lái)延長(zhǎng)烤焙面制品的貨架期。
[0013] 有益效果
[0014] 專利號(hào)為"ZL 201310043628. 5"雖然公開(kāi)了 a-淀粉酶具有高酶活，以及中溫特 性、耐鹽性和良好的穩(wěn)定性，但是并沒(méi)有公開(kāi)其產(chǎn)物的組成。發(fā)明人在后續(xù)研究中驚喜的發(fā) 現(xiàn)該淀粉酶不止具有前述的諸多優(yōu)點(diǎn)，而且其酶解產(chǎn)物中麥芽六糖占據(jù)了很大的比例，超 過(guò)50%。且本發(fā)明淀粉酶制得的糖漿與現(xiàn)有的麥芽糖糖漿、麥芽四糖糖漿和麥芽六糖糖漿 相比，葡萄糖含量較低，酶處理后糖組分相對(duì)單一，應(yīng)用性更廣，且由于本發(fā)明涉及到的新 型a -淀粉酶AmyM的優(yōu)良特性，使得低聚糖的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，產(chǎn)物易純化。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1利用申請(qǐng)?zhí)枮?201310043628. 5"涉及的a -淀粉酶處理生淀粉產(chǎn)物HPLC分 析
[0016] 圖2利用申請(qǐng)?zhí)枮?201310043628.5"涉及的a-淀粉酶處理生淀粉后產(chǎn)物中的 寡糖組分HPLC分析
[0017] a圖為麥芽寡糖標(biāo)準(zhǔn)品HPLC分析圖；b圖為AmyM處理生淀粉后水解產(chǎn)物中寡糖組 分HPLC分析圖，其中Ml為葡萄糖，M2為麥芽糖，M3為麥芽三糖，M4為麥芽四糖，M5為麥芽 五糖，M6為麥芽六糖，M7為麥芽七糖。
[0018] 圖3利用申請(qǐng)?zhí)枮?201310043628.5"涉及的α-淀粉酶處理生淀粉后產(chǎn)物中的 寡糖組分TLC分析
[0019] 其中1 - 7為分別為葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥 芽七糖標(biāo)準(zhǔn)品，8 -10為可溶性淀粉經(jīng)α -淀粉酶AmyM處理10分鐘，30分鐘和1小時(shí)后的 產(chǎn)物組成
[0020] 圖4商業(yè)化淀粉酶ΒΑΝ800和新型α -淀粉酶對(duì)比處理生淀粉后產(chǎn)物HPLC分析
[0021] 其中a圖：新型α -淀粉酶不同時(shí)間（I. 5h，3h，5h，12h)處理生淀粉HPLC圖；b圖： 商業(yè)化淀粉酶BAN800與新型α-淀粉酶3h處理生淀粉HPLC圖；c圖：商業(yè)化淀粉酶BAN800 與新型α -淀粉酶12h處理生淀粉HPLC圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1新型α -淀粉酶的制備
[0023] 詳見(jiàn)中國(guó)發(fā)明專利201310043628. 5說(shuō)明書(shū)實(shí)施例1?2。
[0024] 實(shí)施例2.新型α -淀粉酶活性測(cè)定及產(chǎn)物薄板層析分析
[0025] I. Oml 0· 5%可溶性淀粉（50mM pH7. OTris - HCl緩沖液）（先加熱到50°C )添加 1 μ 1酶液（原液稀釋10倍后），50°C條件下反應(yīng)IOmin后，加入2ml DNS即定容到3ml后， 沸水浴5min，冷卻，于OD54tl下測(cè)定其吸光值，對(duì)照組為熱失活1 μ 1酶液（原液稀釋10倍 后），處理同上。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所測(cè)淀粉酶活，50°C條件下每分鐘產(chǎn)生1 μ mol的 還原糖所需的酶量定義為一個(gè)活力單位。
[0026] 淀粉酶AmyM處理淀粉10分鐘，30分鐘和1小時(shí)后利用薄板層析（TLC)分析其產(chǎn) 物組分，TLC條件是：展層劑為正丁醇：甲醇：水=4:2: 1，顯色劑為H2SO4/甲醇（1: 1，v/v)， 顯色條件為90°C烘干lOmin，結(jié)果見(jiàn)圖3,發(fā)現(xiàn)該酶作用于淀粉后的主要產(chǎn)物是麥芽六糖。
[0027] 實(shí)施例3.新型α -淀粉酶水解淀粉產(chǎn)生以麥芽六糖為主的低聚麥芽糖
[0028] 將蠟質(zhì)玉米淀粉（不限于蠟質(zhì)玉米），配成8 %的懸浮液，用磷酸緩沖溶液將pH值 調(diào)節(jié)到6,置于99°C超級(jí)恒溫水浴鍋中至完全糊化，之后將完全糊化的淀粉糊冷卻到50°C 后添加 a-amylase AmyM淀粉酶，a - amylase的添加量為淀粉干基的5% (相當(dāng)于100U 每g干淀粉基質(zhì)），并分別收集3、12h的產(chǎn)物，酶解12h后升溫到100°C保溫20min滅酶，收 集的產(chǎn)物使用KS803柱分析。色譜柱為Shodex KS - 803 (8mmX 300mm)，檢測(cè)器為示差檢測(cè) 器。樣品配制成2g/L的溶液，過(guò)0. 45 μ m的膜，以超純水為流動(dòng)相，進(jìn)樣量20 μ L，流速為 0. 8mL/min，柱溫70°C，檢測(cè)器溫度為50°C。
[0029] 玉米淀粉酶解后的產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)（圖1)，四糖以上，52. 24%;三糖，8. 14%，二糖， 5. 94%;其他寡糖，33. 68%。通過(guò)對(duì)酶解產(chǎn)物HPLC分析其具體麥芽低聚糖組分的相對(duì)含量 (圖2)，發(fā)現(xiàn)Gl -葡萄糖，3.9% ;G2 -麥芽糖，6. 2% ;G3 -麥芽三糖，8. 1% ;G4 -麥芽四糖， 8.3%;65-麥芽五糖，8.8%;66-麥芽六糖，59.4%;67-麥芽七糖，5.3%。
[0030] 同時(shí)選取商業(yè)化淀粉酶BAN800作為對(duì)比試驗(yàn)，將上述蠟質(zhì)玉米淀粉，配成8%的 懸浮液，用磷酸緩沖溶液將PH值調(diào)節(jié)到6,置于99°C超級(jí)恒溫水浴鍋中至完全糊化，之后將 完全糊化的淀粉糊冷卻到70°C后添加 BAN800 a - amylase，淀粉酶添加量和后續(xù)檢測(cè)分析 方法同上，結(jié)果見(jiàn)圖4。
[0031] 產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)商業(yè)化淀粉酶BAN800 (購(gòu)自諾維信公司）水解產(chǎn)物較復(fù)雜，在3h生 長(zhǎng)低聚糖較少，在12h才趨向穩(wěn)定，其G6 -麥芽六糖產(chǎn)量明顯低于本發(fā)明淀粉酶。
[0032] 實(shí)施例4.利用新型α -淀粉酶制備富含麥芽麥芽六糖糖漿
[0033] 利用新型α -淀粉酶制備富含麥芽麥芽六糖糖漿可以在現(xiàn)有的淀粉加工工藝過(guò) 程中實(shí)現(xiàn)。在配料罐內(nèi)，把粉漿乳調(diào)到25 %?35 %淀粉懸漿，pH值用Na2CO3調(diào)到5. 0 -7. 0， 料液攪拌均勻后用泵把粉漿泵入噴射液化器，在噴射其中粉漿和蒸汽直接相遇進(jìn)行糊化， 出料溫度控制在110 - 115°C，從噴射器中出來(lái)的糊化料液降溫至50°C，按IOOU/克干淀粉 的量加入淀粉酶AmyM，保溫處理3小時(shí)。終點(diǎn)后，將料液噴射加熱80°C滅酶。首先用過(guò)濾 機(jī)除渣過(guò)濾，再加入活性炭脫色半小時(shí)，進(jìn)行脫色過(guò)濾，然后將糖液進(jìn)行二次脫色，脫色后 進(jìn)行離子交換。將離交后的糖液用五效降膜式蒸發(fā)器濃縮至產(chǎn)品要求。
[0034] 取樣對(duì)制備的麥芽六糖糖漿進(jìn)行產(chǎn)物分析，發(fā)現(xiàn)該糖漿麥芽六糖組分占總組分的 約53%，其他寡糖組分占總組分的約4%，其他組分約43%，說(shuō)明該糖漿主要組分為麥芽六 糖，為富含麥芽六糖糖漿。
【權(quán)利要求】
1. 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM在處理淀粉制備富含麥芽六糖 糖漿方面的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的糖漿組分組成為：麥芽四糖以上 低聚糖含量50%以上，麥芽三糖含量8-10%，麥芽糖含量低于6%，其他低聚糖含量低于 35%;所述的麥芽四糖以上低聚糖為4?7個(gè)單糖聚合形成的低聚糖；所述的其他低聚糖為 八個(gè)及以上單糖聚合形成的低聚糖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的糖漿中七糖及以下低聚糖的組成 為：G1-葡萄糖3-5% ;G2-麥芽糖5-7% ;G3-麥芽三糖6-8% ;G4-麥芽四糖7-9% ;G5-麥 芽五糖8-10% ;G6-麥芽六糖55-60% ;G7-麥芽七糖約4-6%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的淀粉來(lái)源于玉米、小麥、土豆。
5. 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM酶解淀粉產(chǎn)物在制備運(yùn)動(dòng)飲料、 發(fā)酵飲料和/或啤酒發(fā)酵中的應(yīng)用。
6. 氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的a-淀粉酶AmyM在面包烘培中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P19/02GK104404107SQ201410713567
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】崔中利, 李周坤, 黃彥 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)