西葫蘆白粉病顯性抗病基因pm1的連鎖分子標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了與西葫蘆白粉病顯性抗病基因 Pm1 的連鎖SSR分子標記（Pm-136），屬于蔬菜分子抗病育種【技術領域】，涉及白粉病顯性抗病基因的連鎖SSR分子標記及其應用。所述的分子標記Pm-136與抗病基因的遺傳距離為1.7 cm。利用分子標記Pm-136可快速準確的檢測抗病性狀轉(zhuǎn)育后代植株是否攜帶 Pm1 抗病基因，從而顯著提高抗病育種效率，縮短育種周期。本發(fā)明獲得的Pm-136標記具有穩(wěn)定可靠、操作簡單、重復性好等優(yōu)點，在鑒別抗、感品種和抗病轉(zhuǎn)育單株時具有非常高的利用價值。
【專利說明】西葫蘆白粉病顯性抗病基因 pm1的連鎖分子標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及蔬菜分子抗病育種【技術領域】，具體為一種與西葫蘆 L )白粉病顯性抗病基因也2連鎖的SSR分子標記，以及該標記在檢測抗病植株中的應用。

【背景技術】
[0002] 西葫蘆是全球范圍內(nèi)普遍栽植的南瓜屬重要蔬菜之一，在我國的栽培面積逐年增 力口，特別是近年來保護地設施栽培發(fā)展迅速，已成為繼黃瓜之后的第二大栽培作物。西葫蘆 生產(chǎn)對農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及豐富人民的菜籃子有著重要意義。
[0003] 白粉病是危害西葫蘆中后期生產(chǎn)的重要病害之一，植株感染白粉病后光合作用嚴 重降低，植株生長緩慢，降低產(chǎn)量與品質(zhì)，產(chǎn)量損失可達40%左右。西葫蘆白粉病主要由單 囊殼菌（和二抱白粉菌侵染導致,西 葫蘆對白粉病沒有免疫類型，高抗材料也非常少，隨著保護地西葫蘆生產(chǎn)面積的迅速增加， 在高溫高濕的環(huán)境下，白粉病的發(fā)生變的越來越為嚴重，已經(jīng)成為西葫蘆生產(chǎn)和制種的主 要障礙。盡管白粉病可采用化學防治，但由于危害西葫蘆白粉病的生理小種較多，分化快， 化學藥劑很難有效保證生產(chǎn)，而且化學防治污染環(huán)境，危害消費者健康。因此，培育和推廣 抗白粉病品種是解決這一問題最經(jīng)濟、安全、有效的措施。但目前，傳統(tǒng)抗病育種存在抗病 基因轉(zhuǎn)育困難，抗病性狀鑒別準確性差，抗病育種效率低、周期長等問題，導致生產(chǎn)中抗病 品種少，不能滿足生產(chǎn)需要。緊密連鎖的分子標記可以加速抗病育種進程、提高選擇的準確 性，是分子標記輔助選擇育種的必要條件。而與瓜類白粉病抗性連鎖的分子標記的研究主 要集中在西瓜、甜瓜及黃瓜上，國內(nèi)外至今未見西葫蘆的相關研究報道。因此，開發(fā)與西葫 蘆白粉病抗病基因緊密連鎖的分子標記，對于提高西葫蘆抗病育種效率，拓展抗病基因應 用范圍，保障西葫蘆的健康生產(chǎn)具有重要的實際應用價值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有西葫蘆白粉病抗病育種技術的上述不足，提供西葫蘆白 粉病顯性抗病基因的分子標記。本發(fā)明的另一目的是提供該西葫蘆白粉病抗病基因 /^7的分子標記應用。
[0005] 本發(fā)明的一個目的提供西葫蘆白粉病顯性抗病基因也2的分子標記可通過如下 技術方案實現(xiàn)： 西葫蘆白粉病顯性抗病基因的連鎖SSR分子標記，所述的分子標記為Pm-136,其 具有分子序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
[0006] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的獲得分子標記是通過以下方案實現(xiàn)的： 所述分子標記的獲得方法包括如下步驟： 應用SSR-BSA技術：以西葫蘆自交系BS15和BS9分別作為感病和抗病親本配制&代 分離群體，用SSR引物篩選與西葫蘆白粉病顯性抗病基因也7連鎖的分子標記，得到共顯性 分子標記Pm-136,該標記與抗病基因/^7的遺傳連鎖距尚為I. 7 cM。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是通過以下方案實現(xiàn)的。
[0008] -種所述分子標記在對西葫蘆種質(zhì)資源白粉病抗病基因的鑒定和轉(zhuǎn)移中的應用。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是通過以下方案實現(xiàn)的。
[0010] 一種檢測西葫蘆白粉病抗病基因的方法，用以下的一對分子標記引物PCR擴 增待檢測西葫蘆基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物： 分子標記Pm-136 : 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2， 如果用引物Pm-136能夠擴增出131 bp的擴增片段，則標志著待檢測西葫蘆存在白粉 病顯性抗病基因/^i。
[0011] 檢測方法的條件是：所述PCR反應體積為15yL，其中IOXbuffer 1.5yL，2. 5 mM dNTPs 0· 3μ L，Tag 酶 0· 2μ L，10 μΜ 引物各 0· 3μ L，模版DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15μ L ; PCR反應的條件為DNA 95°C預變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循 環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是通過以下方案實現(xiàn)的。
[0013] 一種篩選抗白粉病抗病基因也2西葫蘆的方法，用所述的分子標記對擴增待檢西 葫蘆基因組DNA，用所述的分子標記Pm-136能夠擴增出131 bp的擴增片段，則標志該待檢 西葫蘆為存在抗病基因的抗白粉病毒病西葫蘆。
[0014] 篩選方法的條件是：所述PCR反應體積為15 μ L，其中IOXbuffer 1. 5 μ L，2. 5 mM dNTPs 0· 3μ L，Tag 酶 0· 2μ L，10 μΜ 引物各 0· 3μ L，模版DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15μ L ; 所述PCR反應的條件為DNA 95°C預變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 30s，循環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。
[0015] 有益效果： 本發(fā)明在西葫蘆自交系BS9中發(fā)現(xiàn)了一個白粉病顯性抗病基因也7,其優(yōu)異的抗病 表現(xiàn)在西葫蘆抗病育種中具有重要的利用價值。獲得了與抗病基因緊密連鎖的分子標記 Pm-136。利用獲得的分子標記進行輔助選擇，成功的將抗病基因通過雜交、回交轉(zhuǎn)育的方法 導入西葫蘆優(yōu)良自交系BS15中，使其獲得白粉病抗性。
[0016] 1、在西葫蘆自交系BS9中鑒定了一個白粉病顯性抗病基因也7。
[0017] 2、獲得與西葫蘆白粉病抗病基因也7緊密連鎖的共顯性分子標記Pm-136。Pm-136 與抗病基因的遺傳距離為I. 7 cm。利用該標記能夠通過輔助選擇鑒定將抗病基因成功導入 其它西葫蘆感病優(yōu)良自交系，使之獲得抗病性狀。
[0018] 3、鑒定方便。分子標記具有擴增穩(wěn)定、檢測方便、快速準確等優(yōu)點。用標記Pm-136 檢測西葫蘆抗病基因&i，可以確定抗病基因是否存在以及存在狀態(tài)，并預測植株對白粉病 的抗性，加快該抗病基因的利用。
[0019] 4、本發(fā)明提出了利用西葫蘆白粉病抗病種質(zhì)資源BS9中抗病基因的方法：利用分 子標記篩選，通過雜交與回交轉(zhuǎn)育將抗病基因?qū)胛骱J優(yōu)良的感病自交系中，利用該方 法成功將抗病基因?qū)胛骱J優(yōu)良自交系BS15,使其獲得了白粉病抗性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為分子標記Pm-136與西葫蘆抗病基因/^7的遺傳連鎖圖，左邊為標記間的圖 距； 圖2為分子標記擴增帶型； Pm-136擴增帶型，其中Pl為感病親本BS15, P2為抗病親本BS9, Fl為雜交一代；1-23 為以BS15為輪回親本的回交單株；M :Trans DNA markerll，箭頭所指為131 bp特異擴增 條帶。

【具體實施方式】
[0021] 實施例1 西葫蘆白粉病顯性抗病基因的連鎖SSR分子標記，所述的分子標記為Pm-136,其具 有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
[0022] 所述的西葫蘆白粉病顯性抗病基因也2的連鎖SSR分子標記的獲得方法，、包括 如下步驟： 應用SSR-BSA技術：以西葫蘆自交系BS15和BS9分別作為感病和抗病親本配制&代 分離群體，用SSR引物篩選與西葫蘆白粉病顯性抗病基因也7連鎖的分子標記，得到共顯性 分子標記Pm-136,該標記與抗病基因/^7的遺傳連鎖距尚為I. 7 cm。
[0023] 所述的分子標記在對西葫蘆種質(zhì)資源白粉病抗病基因的鑒定和轉(zhuǎn)移中的應用。
[0024] -種檢測西葫蘆白粉病抗病基因也2的方法，包括以下步驟： 用以下的一對分子標記引物PCR擴增待檢測西葫蘆基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物： 分子標記Pm-136 : 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2， 用所述分子標記Pm-136能夠擴增出131 bp的擴增片段，則標志著待檢測西葫蘆存在 白粉病顯性抗病基因/^i。
[0025] 進一步的，所述 PCR 反應體積為 15 μ L，其中 IOXbuffer 1.5 μ L，2.5 mM dNTPs 0· 3 μ L，Tag 酶 0.2 μ L，10 μ M 引物各 0.3 μ L，模版 DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15 μ L。所述 PCR 反應的條件為DNA 95°C預變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán) 35次，最后72°C延伸lOmin。
[0026] -種篩選抗白粉病抗病基因也2西葫蘆的方法，用所述的分子標記對擴增待檢西 葫蘆基因組DNA，用所述的分子標記Pm-136能夠擴增出131 bp的擴增片段，則標志該待檢 西葫蘆為存在抗病基因的抗白粉病毒病西葫蘆。
[0027] 進一步的，所述 PCR 反應體積為 15 μ L，其中 IOXbuffer 1.5 μ L，2. 5 mM dNTPs 0· 3 μ L，Tag 酶 0.2 μ L，10 μ M 引物各 0.3 μ L，模版 DNA 30 ng，加 CldH2O 至 15 μ L。所述 PCR 反應的條件為DNA 95°C預變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán) 35次，最后72°C延伸10min。
[0028] 實施例2 本實施例具體描述了所述的與西葫蘆白粉病顯性抗病基因的連鎖SSR分子標記的 獲得方法，包括以下步驟： (一）西葫蘆自交系BS15與BS9 F2代的創(chuàng)建與表型鑒定： (1)西葫蘆自交系BS15 (母本）與BS9 (父本）進行雜交得到雜種F1，F(xiàn)1自交產(chǎn)生F2 代群體。
[0029] (2)F2代群體單株種植于溫室營養(yǎng)缽內(nèi)，外罩防蟲網(wǎng)，子葉完全展開后接種白粉病 菌孢子，接種15天后進行抗病性狀調(diào)查。鑒定結(jié)果見表1。
[0030]

【權利要求】
1. 西葫蘆白粉病顯性抗病基因也2的連鎖SSR分子標記，其特征在于，所述的分子標記 為Pm-136,其具有序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所述的DNA序列。
2. -種如權利要求1所述的西葫蘆白粉病顯性抗病基因也2的連鎖SSR分子標記的 獲得方法，其特征在于，包括如下步驟： 應用SSR-BSA技術：以西葫蘆自交系BS15和BS9分別作為感病和抗病親本配制&代 分離群體，用SSR引物篩選與西葫蘆白粉病顯性抗病基因也7連鎖的分子標記，得到共顯性 分子標記Pm-136,該標記與抗病基因/^7的遺傳連鎖距尚為1. 7 cm。
3. -種如權利要求1所述的分子標記在對西葫蘆種質(zhì)資源白粉病抗病基因的鑒定和 轉(zhuǎn)移中的應用。
4. 一種檢測西葫蘆白粉病抗病基因的方法，其特征在于， 用以下的一對分子標記引物PCR擴增待檢測西葫蘆基因組DNA，并檢測擴增產(chǎn)物： 分子標記Pm_136 : 左端引物序列為SEQ ID NO. 1， 右端引物序列為SEQ ID NO. 2， 用所述分子標記Pm-136能夠擴增出131 bp的擴增片段，則標志著待檢測西葫蘆存在 白粉病顯性抗病基因/^i。
5. 根據(jù)權利要求4所述的檢測西葫蘆白粉病抗病基因的方法，其特征在于，所述 PCR 反應體積為 15iiL，其中 lOXbuffer 1.5iiL，2.5 mM dNTPs 0.3iiL，Tag 酶 0.2iiL， 1〇1^引物各0.3111，模版0嫩3〇1^，加(1(11120至1 5111。
6. 根據(jù)權利要求4所述的檢測西葫蘆白粉病抗病基因的方法，其特征在于，所述 PCR反應的條件為DNA 95°C預變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循 環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。
7. -種篩選抗白粉病抗病基因西葫蘆的方法，其特征在于，用權利要求1所述的分 子標記對擴增待檢西葫蘆基因組DNA，用所述的分子標記Pm-136能夠擴增出131 bp的擴增 片段，則標志該待檢西葫蘆為存在抗病基因的抗白粉病毒病西葫蘆。
8. 根據(jù)權利要求7所述的篩選抗白粉病抗病基因西葫蘆的方法，其特征在于，所述 PCR 反應體積為 15iiL，其中 lOXbuffer 1.5iiL，2.5 mM dNTPs 0.3iiL，Tag 酶 0.2iiL，10 1^引物各0.31^，模版0嫩30叩，加(1(11120至15111。
9. 根據(jù)權利要求7所述的篩選抗白粉病抗病基因西葫蘆的方法，其特征在于，所述 PCR反應的條件為DNA 95°C預變性3min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，循 環(huán)35次，最后72°C延伸lOmin。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498484SQ201410717699
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月1日 優(yōu)先權日:2014年12月1日
【發(fā)明者】李海真, 張國裕, 張帆, 賈長才, 姜立綱 申請人:北京市農(nóng)林科學院