一種雙重組位點(diǎn)的雙向啟動(dòng)植物表達(dá)載體系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種雙重組位點(diǎn)的雙向啟動(dòng)植物表達(dá)載體系統(tǒng)，由一個(gè)雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體pRGFL和兩個(gè)分別帶有特異重組位點(diǎn)的克隆載體p-FRT、p-loxp組成。本發(fā)明所提供的雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體pRGFL是經(jīng)改造的含有特定DNA分子的植物表達(dá)載體，本發(fā)明所提供的兩個(gè)分別帶有特異重組位點(diǎn)的克隆載體是在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)分別插入特定DNA分子的重組載體。本發(fā)明的克隆載體p-FRT、克隆載體p-loxp經(jīng)過XcmI酶或EcorV酶消化后形成帶有T末端或平末端的載體，可以直接與目的基因的PCR產(chǎn)物連接達(dá)到克隆的目的。克隆載體p-FRT、克隆載體p-loxp上的目的基因在對應(yīng)的重組酶的介導(dǎo)下，可以分別通過特異位點(diǎn)重組將雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體上的熒光蛋白報(bào)告基因替換，達(dá)到將目的基因轉(zhuǎn)移至植物表達(dá)載體的目的，過程中只需要重組酶介導(dǎo)，不需其它操作，簡便易行。
【專利說明】一種雙重組位點(diǎn)的雙向啟動(dòng)植物表達(dá)載體系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體及其構(gòu)建系統(tǒng)。

【背景技術(shù)】
[0002]在植物轉(zhuǎn)基因研究中，兩個(gè)基因協(xié)同轉(zhuǎn)化是研究多基因間互作關(guān)系的理想方法。目前可以通過在載體上串聯(lián)基因或利用雙向啟動(dòng)子的方法在同一個(gè)載體中攜帶兩個(gè)不同的基因，再轉(zhuǎn)化植物達(dá)到兩個(gè)基因協(xié)同轉(zhuǎn)化的效果。上述方法的載體構(gòu)建中，多為采用酶切、連接的方法將目的基因逐個(gè)連接到載體上，載體序列限制了只有少數(shù)幾個(gè)酶切位點(diǎn)能用于構(gòu)建，但如果目的基因內(nèi)部剛好也帶有構(gòu)建所需的酶切位點(diǎn)，則不能用酶切連接的方法進(jìn)行構(gòu)建，這就給上述方法的應(yīng)用帶來了限制。
[0003]位點(diǎn)特異性重組是首先發(fā)現(xiàn)于原核生物中的一種DNA重組方式，它由重組酶介導(dǎo)在特定的成對序列之間完成DNA交換重組，并且這種重組只在特定的重組酶作用下，識(shí)別特定的成對序列并完成重組，所以重組酶及其特異識(shí)別的序列被稱為重組酶系統(tǒng)。Cre/1xP是從大腸桿菌噬菌體Pl中獲得的重組酶系統(tǒng)，在這個(gè)系統(tǒng)中，Cre重組酶催化兩個(gè)34bp的同源1xP序列間的重組。FLP/FRT則是源于釀酒酵母的重組酶系統(tǒng)，34bp的FRT序列是重組酶FLP的特異作用位點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種雙重組位點(diǎn)的雙向表達(dá)植物表達(dá)載體系統(tǒng)，由一個(gè)雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體PRGFL和兩個(gè)分別帶有特異重組位點(diǎn)的克隆載體p-FRT、p-loxp 組成。
[0005]本發(fā)明所提供的雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體pRGFL是以pBI121基礎(chǔ)改造的含有如下DNA分子的重組表達(dá)載體:
[0006]自5’末端依次含有NoS終止子、SalI酶識(shí)別序列、反向FRT序列、紅色熒光蛋白基因、反向FRT序列、SpeI酶識(shí)別序列、雙向啟動(dòng)子、BamHI酶識(shí)別序列、反向1xP序列、綠色熒光蛋白基因、反向1xP序列、KpnI酶識(shí)別序列、NoS終止子。
[0007]所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列I自5’末端第4356-7983位。
[0008]本發(fā)明所提供的兩個(gè)分別帶有特異重組位點(diǎn)的克隆載體是在出發(fā)載體PMD18T-Vector的多克隆位點(diǎn)分別插入特定DNA分子的重組載體。
[0009]克隆載體p-FRT在多克隆位點(diǎn)插入如下DNA分子:自5’末端依次含有正向FRT序列、XcmI酶識(shí)別序列、SpeI酶識(shí)別序列、EcorV酶識(shí)別序列、正向FRT序列。
[0010]克隆載體p-loxp在多克隆位點(diǎn)插入如下DNA分子:自5’末端依次含有反向1xP序列、XcmI酶識(shí)別序列、SpeI酶識(shí)別序列、EcorV酶識(shí)別序列、反向1xP序列。
[0011]克隆載體p-FRT和p-loxp中所包含的XcmI酶識(shí)別序列如下:ccacccttattctgg
[0012]以上所述的DNA分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]本發(fā)明的克隆載體p-FRT、克隆載體p-loxp經(jīng)過XcmI酶或EcorV酶消化后形成帶有T末端或平末端的載體，可以直接與目的基因的PCR產(chǎn)物連接達(dá)到克隆的目的?？寺≥d體p-FRT、克隆載體p-loxp上的目的基因在對應(yīng)的重組酶的介導(dǎo)下，可以分別通過特異位點(diǎn)重組將雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體上的熒光蛋白報(bào)告基因替換，達(dá)到將目的基因轉(zhuǎn)移至植物表達(dá)載體的目的，過程中只需要重組酶介導(dǎo)，不需其它的酶切、連接操作，簡便易行且不受酶切識(shí)別序列限制。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1 為 Gm抗性基因序列 PCR擴(kuò)增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；I為Gm抗性基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0015]圖2 為陽性克隆菌落 PCR 驗(yàn)證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3為陽性克隆PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0016]圖3為Xcm I酶切連載體連接效果圖。左:氨芐抗性平板；右:氨芐和慶大霉素雙抗性平板。
[0017]圖4 為 Gm抗性基因序列 PCR擴(kuò)增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；I為Gm抗性基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0018]圖5 為陽性克隆菌落 PCR 驗(yàn)證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3為陽性克隆PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0019]圖6為EcoR V酶切連載體連接效果圖。左:氨芐抗性平板；右:氨芐和慶大霉素雙抗性平板。
[0020]圖7 為 GusA 基因序列 PCR 擴(kuò)增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；1為GusA基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021]圖8 為陽性克隆菌落 PCR 驗(yàn)證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3為陽性克隆PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022]圖9 為菌落PCR驗(yàn)證圖。M為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;I 為用 GusAl、GusA2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果；2為用GFP2、GFP2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果；3為用RED1、RED2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果；a為重組成功質(zhì)粒模板PCR驗(yàn)證結(jié)果；b為對照質(zhì)粒模板PCR驗(yàn)證結(jié)果。
[0023]圖10為農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果圖。a為農(nóng)桿菌侵染葉片；b為對照。
[0024]圖11 為 GusA 基因序列 PCR 擴(kuò)增圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ；I為GusA基因序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0025]圖12 為菌落 PCR驗(yàn)證圖。M 為 GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;1、2、3 為陽性克隆PCR驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0026]圖13為菌落PCR驗(yàn)證圖。M為GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder ;I 為用GusAl、GusA2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果；2為用GFP2、GFP2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果；3為用RED1、RED2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果；a為重組成功質(zhì)粒模板PCR驗(yàn)證結(jié)果；b為對照質(zhì)粒模板PCR驗(yàn)證結(jié)果
[0027]圖14為農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果圖。a為農(nóng)桿菌侵染葉片；b為對照。

【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的一種雙重組位點(diǎn)的雙向表達(dá)植物表達(dá)載體系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0029]實(shí)施例1、應(yīng)用克隆載體p-FRT通過XcmI酶消化并克隆目的基因
[0030]將克隆載體p-FRT質(zhì)粒經(jīng)過XcmI酶消化，條件為37°C，12h，將產(chǎn)物回收。
[0031]以帶有慶大霉素抗性基因的pPHlJI質(zhì)粒為模板，以Gl，G2為引物，用Taq酶PCR擴(kuò)增得到帶有3’ A末端的慶大霉素抗性基因序列:
[0032]Gl: aattgacataagcctgttcggt,
[0033]G2: tgacaatttaccgaacaactcc。
[0034]PCR 擴(kuò)增條件為:95°C 預(yù)變性 5mins; 95 °C 30s ；58°C 30s ；72°C Imin ；28 循環(huán)；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示，圖1中I為擴(kuò)增產(chǎn)物，為800bp左右片段。
[0035]PCR產(chǎn)物回收后與消化過的p-FRT連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數(shù)配制。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli涂布在含氨芐和慶大霉素的LA平板上進(jìn)行篩選，同時(shí)涂布只含氨芐的平板統(tǒng)計(jì)連接效率。
[0036]在氨芐和慶大霉素雙抗生素平板上挑取菌落采用Gl、G2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖2所示，圖2中1、2、3為菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，為800左右片段，與預(yù)期相符。
[0037]含氨芐和慶大霉素的平板上菌落數(shù)為成功連接外源片段獲得慶大霉素抗性菌落，只含氨芐的平板的菌落數(shù)則為包含了載體自連的菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)連接效率，
[0038]連接效率=含氨芐和慶大霉素的平板菌落數(shù)/只含氨芐的平板的菌落數(shù)
[0039]平板菌落生長情況如圖3，計(jì)算連接效率=51/388=13.14%
[0040]實(shí)施例2、應(yīng)用克隆載體p-loxp通過EcorV酶消化并克隆目的基因
[0041]將克隆載體p-loxp質(zhì)粒經(jīng)過EcorV酶消化，條件為37°C，12h，將產(chǎn)物回收。
[0042]以帶有慶大霉素抗性基因的pPHlJI質(zhì)粒為模板，以Gl，G2為引物用/7/1/酶PCR擴(kuò)增得到帶有平末端的慶大霉素抗性基因序列:
[0043]Gl: aattgacataagcctgttcggt,
[0044]G2: tgacaatttaccgaacaactcc。
[0045]PCR 擴(kuò)增條件為:95°C 預(yù)變性 5mins;95°C 30s ；58°C 30s ；72°C Imin ；28 循環(huán)；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖4所示，圖4中I為擴(kuò)增產(chǎn)物，為800bp左右片段。
[0046]PCR產(chǎn)物回收后與消化過的p-loxp連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數(shù)配制。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli涂布在含氨芐和慶大霉素的LA平板上進(jìn)行篩選，同時(shí)涂布只含氨芐的平板統(tǒng)計(jì)連接效率。
[0047]在氨芐和慶大霉素雙抗生素平板上挑取菌落采用Gl、G2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖5所示，圖5中1、2、3為菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，為800左右片段，與預(yù)期相符。
[0048]含氨芐和慶大霉素的平板上菌落數(shù)為成功連接外源片段獲得慶大霉素抗性菌落，只含氨芐的平板的菌落數(shù)則為包含了載體自連的菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)連接效率，
[0049]連接效率=含氨芐和慶大霉素的平板菌落數(shù)/只含氨芐的平板的菌落數(shù)
[0050]平板菌落生長情況如圖6，計(jì)算連接效率=91/1296=7.02%
[0051]實(shí)施例3、重組酶FLP介導(dǎo)⑶S基因重組替換紅色熒光蛋白基因
[0052]將克隆載體p-FRT質(zhì)粒經(jīng)過XcmI酶消化，條件為37°C，12h，將產(chǎn)物回收。
[0053]以帶有⑶S基因的pBI 121質(zhì)粒為模板，以Gusl，Gus2為引物，用Taq酶PCR擴(kuò)增得到帶有3’ A末端的GUS基因序列:
[0054]GUSl: atgttacgtcctgtagaaacc,
[0055]GUS2: tcattgtttgcctccctg。
[0056]PCR 擴(kuò)增條件為:95°C 預(yù)變性 5mins;95°C 30s ；58°C 30s ；72°C 2min ；28 循環(huán)；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖7所示，圖7中I為擴(kuò)增產(chǎn)物，為1800bp左右片段。
[0057]PCR產(chǎn)物回收后與消化過的p-FRT連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數(shù)配制。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli涂布在含氨芐LA平板上進(jìn)行篩選，挑取菌落采用GUSl和載體上多克隆位點(diǎn)下游的測序引物M13-47引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，目的是挑選插入方向正確的重組載體。電泳結(jié)果如圖8所示，圖8中，1、2、3為菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，為1800左右片段，與預(yù)期相符。
[0058]將純化后的雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體pRGFL和帶有⑶S基因的p_FRT載體按摩爾比1:2配制反應(yīng)體系，將純化的FLP蛋白與上述底物在反應(yīng)緩沖液(2mMMgC12, 70mM NaCl, 50mMTris-HCl, pH7.5)中 30°C反應(yīng) lh，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli 涂布含卡納霉素的LA平板篩選。
[0059]隨機(jī)挑選菌落用GUS1，GUS2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，重組成功的載體應(yīng)該擴(kuò)增得到1800左右⑶S基因片段，而未成功重組的載體則擴(kuò)增不到目的片段，同時(shí)使用RED1、RED2引物驗(yàn)證，未成功重組的載體應(yīng)擴(kuò)增到SOObp左右的紅色熒光蛋白基因片段，而重組成功的載體應(yīng)該不能擴(kuò)增得到目的片段，
[0060]REDl:ctaggttagtggtgg
[0061]RED2:atgaagcttgcctcc
[0062]驗(yàn)證電泳結(jié)果如圖9，圖中a為重組成功的載體，b為對照。
[0063]根據(jù)PCR驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)重組率:
[0064]重組率=陽性克隆數(shù)/驗(yàn)證總菌落數(shù)=2/768=0.26%
[0065]重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，將重組農(nóng)桿菌侵染煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，將侵染后的煙草葉片用熒光顯微鏡觀察檢測熒光蛋白的表達(dá)，同時(shí)GUS組織染色檢測GUS基因的表達(dá)，以未侵染煙草作為對照。
[0066]結(jié)果如圖10，a為侵染葉片，b為對照。在侵染葉片中觀察到綠色熒光蛋白以及GUS顯色反應(yīng)，但未觀察到紅色熒光蛋白。說明按照本發(fā)明的方法成功將⑶S基因重組到pRGFL上，替換掉了原有的紅色熒光蛋白基因，并且⑶S基因可以正常表達(dá)，重組率為0.26%。
[0067]實(shí)施例4、重組酶CRE介導(dǎo)⑶S基因重組替換綠色熒光蛋白基因
[0068]將克隆載體p-loxp質(zhì)粒經(jīng)過XcmI酶消化，條件為37°C，12h，將產(chǎn)物回收。
[0069]以帶有⑶S基因的pBI 121質(zhì)粒為模板，以Gusl, Gus2為引物，用Taq酶PCR擴(kuò)增得到帶有3’ A末端的GUS基因序列:
[0070]GUSl: atgttacgtcctgtagaaacc,
[0071]GUS2: tcattgtttgcctccctgο
[0072]PCR 擴(kuò)增條件為:95°C 預(yù)變性 5mins;95°C 30s ；58°C 30s ；72°C 2min ；28 循環(huán)；72°C 1mins ;4°C保存，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖11所示，圖11中I為擴(kuò)增產(chǎn)物，為1800bp
左右片段。
[0073]PCR產(chǎn)物回收后與消化過的p-loxp連接，連接體系按照載體與外源片段1:3的摩爾數(shù)配制。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli涂布在含氨芐LA平板上進(jìn)行篩選，挑取菌落采用GUSl和載體上多克隆位點(diǎn)下游的測序引物M13-47引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，目的是挑選插入方向正確的重組載體。電泳結(jié)果如圖12所示，圖12中，1、2、3為菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，為1800左右片段，與預(yù)期相符。
[0074]將純化后的雙重組位點(diǎn)雙向表達(dá)植物表達(dá)載體pRGFL和帶有⑶S基因的p-loxp載體按摩爾比1:2配制反應(yīng)體系，將純化的CRE蛋白與上述底物在反應(yīng)緩沖液(2mMMgC12, 70mM NaCl, 50mMTris-HCl, pH7.5)中 30°C反應(yīng) lh，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli 涂布含卡納霉素的LA平板篩選。
[0075]隨機(jī)挑選菌落用GUS1，GUS2引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，重組成功的載體應(yīng)該擴(kuò)增得到1800左右⑶S基因片段，而未成功重組的載體則擴(kuò)增不到目的片段，同時(shí)使用GFP1、GFP2引物驗(yàn)證，未成功重組的載體應(yīng)擴(kuò)增到SOObp左右的綠色熒光蛋白基因片段，而重組成功的載體應(yīng)該不能擴(kuò)增得到目的片段，
[0076]GFPl:atggtgagcaagg
[0077]GFP2:ttacttgtacagctc
[0078]驗(yàn)證電泳結(jié)果如圖13，圖中a為重組成功的載體，b為對照。
[0079]根據(jù)PCR驗(yàn)證結(jié)果統(tǒng)計(jì)重組率:
[0080]重組率=陽性克隆數(shù)/驗(yàn)證總菌落數(shù)=11/384=2.86%
[0081]重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，將重組農(nóng)桿菌侵染煙草葉片進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，將侵染后的煙草葉片用熒光顯微鏡觀察檢測熒光蛋白的表達(dá)，同時(shí)GUS組織染色檢測GUS基因的表達(dá)，以未侵染煙草作為對照。
[0082]結(jié)果如圖14，a為侵染葉片，b為對照。在侵染葉片中觀察到紅色熒光蛋白以及⑶S顯示反應(yīng)，但未觀察到綠色熒光蛋白。說明按照本發(fā)明的方法成功將⑶S基因重組到pRGFL上，替換掉了原有的綠熒光蛋白基因，并且⑶S基因可以正常表達(dá)，重組率為2.86%。
【權(quán)利要求】
1.一種DNA分子，自5’末端依次含有含有NoS終止子、SalI酶識(shí)別序列、反向FRT序列、紅色熒光蛋白基因、反向FRT序列、SpeI酶識(shí)別序列、雙向啟動(dòng)子、BamHI酶識(shí)別序列、反向1xP序列、綠色熒光蛋白基因、反向1xP序列、KpnI酶識(shí)別序列、NoS終止子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于核酸序列為序列表中序列I自5’端4356-7983 位。
3.一種在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入如下序列的DNA分子:自5’末端依次含有正向FRT序列、XcmI酶識(shí)別序列、SpeI酶識(shí)別序列、EcorV酶識(shí)別序列、正向FRT序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于核酸序列包含序列表中序列2。
5.—種在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入如下序列的DNA分子:自5’末端依次含有反向1xP序列、XcmI酶識(shí)別序列、SpeI酶識(shí)別序列、EcorV酶識(shí)別序列、反向1xP序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于核酸序列包含序列表序列3。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、4所述的DNA分子，其特征在于XcmI酶識(shí)別序列如下:ccacccttattctgg。
8.權(quán)利要求1、3、4的所述載體在植物表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK104450696SQ201410721269
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2015年1月5日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月5日
【發(fā)明者】蔣湘寧, 陳博雯, 蓋穎, 王文棋, 張春曉 申請人:北京林業(yè)大學(xué), 蔣湘寧, 蓋穎