一株產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌及其應(yīng)用，涉及果膠酶。產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus)JLT2011，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為：CGMCC No.1.12375。產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus)JLT2011可在制備果膠酶中應(yīng)用。果膠酶的制備方法如下：1)將菌株涂布于2216E培養(yǎng)基平板上，純化后，接入種子培養(yǎng)基RO中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得種子液；2)將種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，再搖床培養(yǎng)，得發(fā)酵液；3)將發(fā)酵液離心得上清液，即為果膠酶液。經(jīng)試驗(yàn)，在培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液的果膠酶的酶活力可以達(dá)到130～154U/ml，具有良好的應(yīng)用前景。CGMCC No 11237520141029
【專利說明】一株產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及果膠酶，具體是涉及一株產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]果膠主要是直鏈α -1, 4糖苷鍵連接的D-半乳糖醛酸殘基組成的復(fù)合多糖，一般帶有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、海藻糖、乳糖等組成的側(cè)鏈，游離的羧基部分或全部與鈣、鉀、鈉離子，特別是與硼化物結(jié)合在一起，含有20種不同的糖苷鍵，是植物細(xì)胞壁和中膠層的重要組成部分。果膠酶是一類分解果膠質(zhì)的酶的總稱，是含有多種組分的復(fù)合酶。果膠酶廣泛分布在高等植物和微生物中。提供一株能產(chǎn)生果膠酶的細(xì)菌對(duì)研究開發(fā)海洋生物資源具有很大的意義。
[0003]中國(guó)專利CN103468582A公開一株利用桔皮粉發(fā)酵產(chǎn)果膠酶制劑的菌株及利用表面活性劑提高其酶活的方法。以日本曲霉(Aspergillusjaponicus)PJOl生產(chǎn)果膠酶制劑，制備所得果膠酶制劑活力以果膠酶活力、纖維素酶活力和半纖維素酶活力表征，果膠酶制劑的生產(chǎn)以粉碎的桔皮粉為唯一碳源，加入查氏培養(yǎng)基中的無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽，然后在液態(tài)發(fā)酵黑曲霉的培養(yǎng)基中添加0.1 %?0.5% (wt)的PEG4000，經(jīng)過3?5天搖床培養(yǎng)，外切果膠酶活力(Exo-Pectinase)，纖維素酶活力(以CMCase酶計(jì))和半纖維素酶活力(以木聚糖酶Xylanase計(jì))較對(duì)照有明顯提高。
[0004]中國(guó)專利CN101386825 —種產(chǎn)果膠酶的工程菌株,提供了一種用于微生物發(fā)酵的產(chǎn)果膠酶的工程菌株。產(chǎn)果膠酶的工程菌株大腸埃希氏菌HDDMG05屬于埃希氏菌屬，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC No:Μ 208082 ;大腸埃希氏菌HDDMG05為革蘭氏陰性菌，無芽孢，菌株個(gè)體呈短桿狀，長(zhǎng)為0.2?0.7 μπι,寬為0.2?0.5 μ m ;大腸埃希氏菌HDDMG05菌落呈圓形，白色，隆起，邊緣呈波浪狀，表面光滑有光澤，透明，菌落挑起軟?？刹捎肔B液體培養(yǎng)基發(fā)酵本發(fā)明大腸埃希氏菌HDDMG05，其發(fā)酵條件與LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的相同；發(fā)酵液中大腸埃希氏菌HDDMG05菌數(shù)濃度為IX 107?IX 108cfu/mL時(shí)發(fā)酵液中果膠酶的酶活力達(dá)8200U/mL以上。
[0005]中國(guó)專利CN101665769公開一株高產(chǎn)原果膠酶的黑曲霉菌株及采用該菌株發(fā)酵提取果膠的方法。所述黑曲霉Aspergillus niger⑶_01從湖南常德一傾倒腐爛柑桔的土壤中篩選，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 209036。發(fā)酵提取果膠的方法包括斜面培養(yǎng)、發(fā)酵、果膠提取等步驟。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一株產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus) JLT2011。
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供一株產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus) JLT2011的應(yīng)用。
[0008]所述產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus) JLT2011,已于2014年10月29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為:CGMCCN0.1.12375。(Gramella flavus) JLT2011為黃色革蘭氏陰性菌，好氧，無芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性的桿狀海洋細(xì)菌；長(zhǎng)為0.6?0.8 μ m，寬為3.0?6.0 μ m，菌落為黃色，圓形，凸起，表面光滑。
[0009]所述一株產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus)JLT2011可在制備果膠酶中應(yīng)用。
[0010]所述果膠酶的制備方法如下:
[0011]I)將菌株涂布于2216E培養(yǎng)基平板上，純化后，接入種子培養(yǎng)基RO中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得種子液；
[0012]2)將種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，再搖床培養(yǎng)，得發(fā)酵液；
[0013]3)將發(fā)酵液離心得上清液，即為果膠酶液。
[0014]在步驟I)中，所述2216E培養(yǎng)基的配方可為(MB，W/V):蛋白胨5.0g，酵母膏
1.0g,檸檬酸鐵0.1g,氯化鈉19.45g，無水氯化鎂5.90g,硫酸鈉3.24g，氯化鈣1.8g，氯化鉀0.55g,碳酸鈉0.16g,溴化鉀0.08g,氯化銀34.0mg,硼酸22.0mg,娃酸鈉4.0mg,氟化鈉
2.40mg,硝酸銨1.60mg,磷酸氫二鈉8.0mg,蒸懼水100g, ρΗ7.6 ;所述純化可米用2?3次純化；所述種子培養(yǎng)基RO的配方可為(W/V):蛋白胨l.0g，酵母膏l(xiāng).0g，氯化鈉20.0g，乙酸鈉1.0g,氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合氯化鈣0.05g,蒸餾水1000g，pH8.0 ;所述搖床培養(yǎng)的條件可在28°C，180rpm搖床培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0015]在步驟2)中，所述種子液的接種量按質(zhì)量百分比可為發(fā)酵培養(yǎng)基的0.2% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方可為:果膠2g，酵母膏1.0g,氯化銨0.5g，氯化鈉20.0g,乙酸鈉1.0g,氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合氯化鈣0.05g,蒸餾水lOOOg，pH 7.6 (Tris-HCl);所述搖床培養(yǎng)的條件可在28°C，180rpm搖床培養(yǎng)48h。
[0016]在步驟3)中，所述離心的條件可為12000gX10min。
[0017]經(jīng)試驗(yàn)，本發(fā)明篩選的具有果膠酶生產(chǎn)能力的細(xì)菌，其在培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液的果膠酶的酶活力可以達(dá)到130?154U/ml，具有良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus) JLT2011在透射電子顯微鏡形態(tài)圖；
[0019]圖2為產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus) JLT2011為基于16s序列，利用MEGA 5.01 中的neighbour-joining, maximum-parsimony,把Gramella flavus和其親緣關(guān)系相近菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；
[0020]圖3為產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus) JLT2011在釕紅平板產(chǎn)生的降解圈。

【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0022]1、目標(biāo)菌的篩選:
[0023]對(duì)來源于中國(guó)大洋22航次的東南太平洋區(qū)域站位采集的深層海水樣品微生物富集，初篩，復(fù)篩，篩選產(chǎn)果膠酶菌。
[0024]具體技術(shù)方案如下:
[0025]初篩:將東南太平洋區(qū)域站位采集的深層海水水樣涂布于用R0(蛋白胨1.0g,酵母膏1.0g,氯化鈉20.0g,乙酸鈉1.0g,氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合氯化鈣0.05g，蒸餾水lOOOg，pH 8.0)。在30°C下培養(yǎng)14d，得到形態(tài)各異的單菌落，并純化，用30%(v/v)甘油(1:1 ;甘油:菌液)保存在_80°C。
[0026]復(fù)篩:將上述保種的細(xì)菌純化接入30ml果膠液體培養(yǎng)基(果膠2g，酵母膏1.0g,氯化銨0.5g，氯化鈉20.0g,乙酸鈉1.0g,氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合氯化鈣0.05g，蒸餾水lOOOg，pH 7.6)中，在28°C，180rpm搖床培養(yǎng)。分離能降解果膠的海洋細(xì)菌。Gramella flavus的篩選方法:從蘋果果膠(Sigma)平板透明圈篩選,具體為配置0.2%的果膠固體培養(yǎng)基(果膠2g，酵母膏1.0g,氯化銨0.5g，氯化鈉20.0g,乙酸鈉1.0g,氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合氯化鈣0.05g,瓊脂15g，蒸餾水lOOOg，pH 7.6);添加
10μ I菌液，培養(yǎng)18?24h，得到菌落直徑，再將I %的釕紅原平板單菌落上，有透明光圈，比較透明光圈和原始菌落直徑對(duì)比，確定有果膠降解酶活性的，最終確定菌株。
[0027]2、形態(tài)特征，生長(zhǎng)條件，生理生化指標(biāo)以及系統(tǒng)發(fā)育樹分析研究表明，菌株JLT2011具有以下特點(diǎn):
[0028]菌株形態(tài)特征:革蘭氏陰性菌，在2216E平板上培養(yǎng)3d后形成黃色、凸起、表面光滑、直徑約為I?1.5_的圓形菌落。在透射電子顯微鏡下觀察，菌體呈桿狀的，無鞭毛，單細(xì)胞為0.6?0.8μηι長(zhǎng),3?6μηι寬。生長(zhǎng)條件:嚴(yán)格好氧,最適生長(zhǎng)溫度為30°C,最適生長(zhǎng)pH5?8，最適生長(zhǎng)鹽度20Z0?8%。
[0029]生理生化特征:氧化酶，過氧化氫酶，酯酶，果膠酶(圖)陽性，無法利用明膠、尿素、幾丁質(zhì)、酪蛋白等。
[0030]產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus)JLT2011在透射電子顯微鏡形態(tài)圖參見圖1 ;
[0031]系統(tǒng)發(fā)育樹分析:菌株JLT2011的G+C為:42.1mol %。GenBank收錄號(hào)是JX397931，全基因組登錄號(hào)為:PRJNA175612。根據(jù)16s的系統(tǒng)發(fā)育樹分析JLT2011與Gramella gaetbulicola的相似性最高為:96.2%,認(rèn)為是Gramella的新種，最終將其命名為 Gramella flavus。
[0032]產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramella flavus) JLT2011為基于16s序列，利用MEGA5.01 中的 neighbour-joining, maximum-parsimony,把 Gramella flavus 和其親緣關(guān)系相近菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹圖參見圖2.
[0033]3、產(chǎn)果膠酶細(xì)菌菌液的制備:
[0034]將保藏號(hào)為=CGMCC N0.1.12375的細(xì)菌接種液體培養(yǎng)基(0.2% pectin ；0.1%yeast ；0.05% NH4C1 ；pH 7.6)中，在28°C，180rpm搖床培養(yǎng)24h,獲得種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液按2%接種量接種于新鮮的液體培養(yǎng)基，于在28°C，180rpm搖床培養(yǎng)48h，即可制得產(chǎn)果膠酶的細(xì)菌菌液。
[0035]4、果膠酶的制備:
[0036]將上述的發(fā)酵菌液經(jīng)高速離心獲取上清液，此即為果膠酶酶液。
[0037]5、果膠酶活性的測(cè)定:
[0038]果膠酶活單位:Ig或Iml酶液在50°C、pH5.0的條件下，Ih分解果膠產(chǎn)生的Img半乳糖醛酸為一個(gè)酶活單位。
[0039]酶活測(cè)定采用3，5- 二硝基水楊酸(DNS)比色法。酶反應(yīng)體系為:1ml果膠酶液+Iml果膠底物(磷酸-檸檬酸緩沖液pH5.0)。酶活測(cè)定過程:將反應(yīng)體系混合均勻立即在50°C水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)30min ;加入2mlDNS試劑混勻后立即放入沸水水浴5min，取出，立即用流動(dòng)冷水冷卻；以半乳糖醛酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為對(duì)照，于540nm處測(cè)定吸光值。經(jīng)沸水浴預(yù)處理1min的失活酶液作為酶活測(cè)定的陰性對(duì)照。
[0040]結(jié)果表明，48h測(cè)得的酶活力為130?154U/ml。
[0041]Gramella flavus在釕紅平板產(chǎn)生的降解圈參見圖3。
【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramellaflavus) JLT2011，已于2014年10月29日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為=CGMCCN0.1.12375。
2.如權(quán)利要求1所述產(chǎn)果膠酶的海洋細(xì)菌(Gramellaflavus) JLT2011在制備果膠酶中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述果膠酶的制備方法，其特征在于其步驟如下: 1)將菌株涂布于2216E培養(yǎng)基平板上，純化后，接入種子培養(yǎng)基RO中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得種子液； 2)將種子液轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，再搖床培養(yǎng)，得發(fā)酵液； 3)將發(fā)酵液離心得上清液，即為果膠酶液。
4.如權(quán)利要求3所述果膠酶的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述2216E培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，檸檬酸鐵0.lg，氯化鈉19.45g，無水氯化鎂5.90g，硫酸鈉3.24g,氯化?丐1.8g,氯化鉀0.55g,碳酸鈉0.16g,溴化鉀0.08g,氯化銀34.0mg,硼酸22.0mg,娃酸鈉4.0mg,氟化鈉2.40mg,硝酸銨1.60mg,磷酸氫二鈉8.0mg,蒸懼水100g,ρΗ7.6。
5.如權(quán)利要求3所述果膠酶的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述純化采用2?3次純化。
6.如權(quán)利要求3所述果膠酶的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述種子培養(yǎng)基RO的配方為:蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g，氯化鈉20.0g,乙酸鈉1.0g，氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合氯化鈣0.05g,蒸餾水100g, ρΗ8.0。
7.如權(quán)利要求3所述果膠酶的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述搖床培養(yǎng)的條件是在28°C，180rpm搖床培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
8.如權(quán)利要求3所述果膠酶的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述種子液的接種量按質(zhì)量百分比為發(fā)酵培養(yǎng)基的0.2%。
9.如權(quán)利要求3所述果膠酶的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:果膠2g，酵母膏1.0g,氯化銨0.5g，氯化鈉20.0g,乙酸鈉1.0g,氯化鉀0.3g，七水合硫酸鎂0.5g，七水合氯化鈣0.05g,蒸餾水lOOOg，pH 7.6 ;所述搖床培養(yǎng)的條件可在28 0C，180rpm 搖床培養(yǎng) 48h。
10.如權(quán)利要求3所述果膠酶的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述離心的條件為12000gX 1min0
【文檔編號(hào)】C12N9/26GK104388361SQ201410723569
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】湯凱, 林穎芳, 焦念志, 劉克韶, 李書慧, 王璐琰 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)