新的耳聾相關(guān)基因突變多位點檢測體系及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，通過使用多重PCR引物及檢測探針檢測耳聾基因突變位點中是否存在突變，所述耳聾基因突變位點包括46個耳聾基因突變位點。本發(fā)明通過對現(xiàn)有多重核酸分子擴增技術(shù)加以改進，設計特定的檢測探針，設置特定的檢測體系組分和反應條件，以同時對常染色體上3個基因，X染色體上的一個基因和線粒體基因上的共46個突變位點進行快速檢測，這些位點在臨床和科研工作中積累的大量數(shù)據(jù)整理得出，除非綜合型耳聾外還可檢測常見的Alport綜合征，與市面已有的同類檢測產(chǎn)品相比該試劑盒能同時檢測更多綜合性/非綜合性耳聾的相關(guān)基因突變位點，檢測可在一個工作日內(nèi)完成，最低僅需20－30納克的DNA即可得到準確的檢測結(jié)果。
【專利說明】新的耳聾相關(guān)基因突變多位點檢測體系及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及遺傳性耳聾分子檢測領(lǐng)域的一種基因突變檢測體系，具體而言，涉及 一種新的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是一種常見的臨床疾病，主要與遺傳因素及環(huán)境因素密切相關(guān)，即可能是由 相關(guān)基因突變引起，也可能是由環(huán)境暴露、創(chuàng)傷、藥物等引起。據(jù)報道對于新生兒的先天性 耳聾50% - 60%是遺傳因素導致，在相關(guān)報道的先天性病例中，有約70%屬于非綜合征性 耳聾。此類病例又可分為常染色體顯性、常染色體隱性、性連鎖和線粒體遺傳性耳聾四類， 已有報道的耳聾相關(guān)位點多達數(shù)百個。
[0003]目前針對遺傳性耳聾檢測診斷方法，較普遍使用是檢測病人耳聾相關(guān)的基因是否 存在缺陷，涉及到DNA檢測的相關(guān)技術(shù)應用。常用的檢測技術(shù)包括：限制酶切指紋一單鏈構(gòu) 象多態(tài)性分析、限制性片段長度多態(tài)性分析、變性高效液相色譜分析、基因芯片、飛行時間 質(zhì)譜、外顯子捕獲技術(shù)、直接測序等技術(shù)，以上各種檢測技術(shù)各存優(yōu)缺點。
[0004] 限制酶切指紋一單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析是用限制性核酸內(nèi)切酶切割目標基因的PCR 擴增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測梅切產(chǎn)物，根據(jù)異常構(gòu)象帶進行目標基因有無突變的判斷。 該方法最主要的問題是不能檢測到所有的突變，由各實驗室報道的突變檢出率沖99%到 35%不等。同時該方法要求多次摸索條件，如電泳溫度，膠中甘油濃度以及膠聯(lián)度等均可影 響檢測的靈敏度。此外，該方法也不能確定突變的精確位置。
[0005] 限制性片段長度多態(tài)性是用特定的限制性內(nèi)切酶水解目標基因的PCR擴增產(chǎn)物， 然后分析酶解產(chǎn)物的電泳圖譜特征，根據(jù)與正常對照的比對結(jié)果來判斷待檢樣品是否存在 某個基因突變，其弱點操作繁瑣，檢出率低，因為并非所有的基因突變都恰好位于某個內(nèi)切 酶的識別區(qū)。
[0006] 變性高效液相色譜分析此技術(shù)是一項在單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析和變性梯度凝膠電 泳基礎上發(fā)展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù)。它能對大批量PCR擴增產(chǎn)物進行篩查， 其在檢測大量致病基因的不同序列方面顯示出高度的敏感性，適合做快速的基因篩查。但 它也有一些不盡如人意之處：（1)它只是提供了定性的信息，而無法得出具體的突變類型 和突變位點。尚需測序等后續(xù)方法證實；（2)其結(jié)果判斷通常是由操作者進行的，容易產(chǎn)生 觀察差異，不利于各實驗室之間的靈敏度比較；(3)許多片段有多個主要解鏈溫度，需要篩 查的溫度較多，增加的工作量。目前該技術(shù)主要用來檢測200 - 300bp大小的DNA片段，長 的DNA片段的檢測尚未見報道。
[0007] 基因芯片因其具有微型化、集約化、標準化和高通量的特點，在感染性疾病、遺傳 性疾病、重癥傳染病和惡性腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優(yōu)勢，可將對應于突變 熱點的寡核苷酸探針合成點或點加于DNA芯片上，通過一次雜交完成對待測樣品多種突變 可能性的篩查，實現(xiàn)對疾病的高效快速診斷，但芯片檢測平臺售價高昂，不利臨床推廣；現(xiàn) 有的臨床耳聾基因檢測芯片只檢測9個突變位點，突變檢出率較低。
[0008] 飛行時間質(zhì)譜方法檢測基因是首先進行PCR擴增目的片斷區(qū)域，然后加入多對特 異性引物，進行單堿基延伸，再將單堿基延伸產(chǎn)物純化后質(zhì)譜分析，根據(jù)不同引物擴增產(chǎn)物 的質(zhì)荷比不同，判斷有無堿基突變。目前，深圳華大基因研究院通過飛行時間質(zhì)譜和外顯子 捕獲兩種檢測方法檢測耳聾基因。外顯子捕獲技術(shù)目前可以檢測非綜合征型耳聾的51個 基因和2個突變位點，和其他比較常見的綜合征型耳聾，例如Alport綜合征、Waardenburg 綜合征等。市面常見的飛行時間質(zhì)譜檢測技術(shù)目前主要檢測中國人群中高發(fā)的20個突變 位點，準確度高但只適用于大量樣本的檢測，對單個樣本的檢測費用較高。
[0009] 直接測序是將聚合酶鏈式反應擴增產(chǎn)物純化、變性后，在測序儀上進行測序，為尋 找突變的金標準。但其儀器設備昂貴，且操作復雜、耗時較長。此外，雜合突變、膠壓縮、GC 富集區(qū)的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數(shù)據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的以上問題，提供一種新的耳聾相關(guān)基因突 變檢測體系及試劑盒，篩選出46個臨床上常見的耳聾相關(guān)基因檢測位點，結(jié)合PCR等技術(shù) 設計和建立起一個高效準確快速的檢測體系，實現(xiàn)在該體系內(nèi)對46個耳聾基因突變位點 的同時快速檢測。
[0011] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0012] 一種新的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，通過使用多重PCR引物及檢測探針檢測耳 聾基因突變位點中是否存在突變，所述耳聾基因突變位點包括
[0013]

【權(quán)利要求】
1. 一種新的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，其特征在于：通過使用多重PCR引物及檢測 探針檢測耳聾基因突變位點中是否存在突變，所述耳聾基因突變位點包括

共46個耳聾基因突變位點。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，其特征在于，包括以下反應步 驟： 1) 將檢測樣本進行多重PCR反應； 2) 多重PCR產(chǎn)物純化； 3) 分型連接反應； 4) 上樣分析。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，其特征在于：所述多重PCR反 應包括 待測DNA樣本， 雙蒸餾水， 2xGC I緩沖液， 2價鎂離子溶液， 脫氧核糖核苷三磷酸， 引物混合液， 熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶； 并進行PCR循環(huán)程序。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，其特征在于：所述引物混合液 為23對多重PCR引物，所述的引物對的序列如SEQ ID NO. :1至SEQ ID NO. :46所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，其特征在于：所述多重PCR產(chǎn) 物純化為在PCR產(chǎn)物中加入1酶單位的SAP酶和1酶單位的Exonuclease I酶，溫浴后滅 活。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，其特征在于：所述分型連接反 應包括 多重PCR產(chǎn)物， IOx連接酶緩沖液， 4xGC溶液， Taq連接酶， 標記混合液， PiMLDR混合液， 雙蒸餾水； 并進行循環(huán)反應。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的耳聾相關(guān)基因突變檢測體系，其特征在于：所述PiMLDR混合 液為46組檢測探針，每組檢測探針包含2條鑒別探針及1條通用探針，所述的檢測探針的 序列如 SEQ ID NO. :47 至 SEQ ID NO. :184 所示。
8. -種耳聾相關(guān)基因突變檢試劑盒，其特征在于，包括： 雙蒸餾水； 2xGC I緩沖液； 2價鎂離子溶液； 脫氧核糖核苷三磷酸； 引物混合液； 熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶； SAP 酶； Exonuclease I 酶； IOx連接酶緩沖液； 4xGC溶液； Taq連接酶； 標記混合液； PiMLDR混合液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的耳聾相關(guān)基因突變檢試劑盒，其特征在于：所述引物混合液 為23對多重PCR引物，所述的引物對的序列如SEQ ID NO. :1至SEQ ID NO. :46所示。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的耳聾相關(guān)基因突變檢試劑盒，其特征在于：所述PiMLDR混 合液為46組檢測探針，每組檢測探針包含2條鑒別探針及1條通用探針，所述的檢測探針 的序列如 SEQ ID NO. :47 至 SEQ ID NO. :184 所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104357578SQ201410728222
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月3日
【發(fā)明者】李海波, 劉德遠, 李紅, 姜正文 申請人:蘇州市立醫(yī)院, 天昊生物醫(yī)藥科技（蘇州）有限公司