南方大口鯰肌肉細(xì)胞系的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法，它是以南方大口鯰背肌為材料，采用組織塊貼壁法啟動(dòng)原代培養(yǎng)，在含胎牛血清、表皮生長(zhǎng)因子和成纖維生長(zhǎng)因子的MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。由本發(fā)明構(gòu)建的南方大口鯰肌細(xì)胞系，目前已傳至第56代，其工藝科學(xué)合理，且細(xì)胞系未經(jīng)過(guò)任何病毒或癌基因轉(zhuǎn)染，可作為環(huán)境毒理學(xué)研究環(huán)境污染的模型，對(duì)水體中存在的各種環(huán)境污染物進(jìn)行污染監(jiān)測(cè)和安全性評(píng)價(jià)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】南方大口鯰肌肉細(xì)胞系的構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用南方大口鯰肌肉組織建立肌細(xì)胞系的方法，具體地指一種南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]南方大口鯰是重要的大型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，天然分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南的各大江河水域中，具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)殖周期短和市場(chǎng)前景好等特點(diǎn)，是極好的水產(chǎn)優(yōu)良養(yǎng)殖品種之一，推廣養(yǎng)殖前景廣闊。但隨著水環(huán)境污染的日益加劇，水體中的各種環(huán)境污染物，包括誘變劑、致癌物、環(huán)境激素、基因毒物和吧、內(nèi)分泌干擾物等對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類(lèi)健康的威脅愈來(lái)愈大。利用魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行環(huán)境污染監(jiān)測(cè)和安全性評(píng)價(jià)，是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)的重要用途之一。建立南方大口鯰的組織細(xì)胞系，能為環(huán)境毒理學(xué)研究提供良好的實(shí)驗(yàn)材料，針對(duì)性的檢測(cè)水體存在的各種環(huán)境污染物對(duì)南方大口鯰的影響，并研究污染物對(duì)南方大口鯰細(xì)胞的作用機(jī)理，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題就是利用南方大口鯰肌肉組織，提供了一種南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法。
[0004]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的一種南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0005]I)首先將體質(zhì)健康的南方大口鯰置于含有濃度為1000單位/mL的青霉素和鏈霉素的水溶液中飼養(yǎng)36?60h，
[0006]2)取出南方大口鯰置于體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中浸泡I?2min后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌剪下背肌，并將背肌置于AIM培養(yǎng)基中浸泡2?3h，其中，25?35min更換一次AM培養(yǎng)基，
[0007]3)將步驟2)浸泡的背肌用眼科剪剪碎成Imm3的小塊，然后用AIM培養(yǎng)基沖洗2?3次，收集20?25個(gè)組織小塊貼到25cm2的原代細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，在室溫下干貼2?4h后，將培養(yǎng)瓶側(cè)放半小時(shí)后，吸出過(guò)多的培養(yǎng)液，每個(gè)培養(yǎng)瓶中緩慢注入4?6mL升的南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液，在22?25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)情況，每隔2?3天用移液管吸出舊的培養(yǎng)基，并離心，然后吸出2?3mL的上清液再加上2?3mL的南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液；即得到南方大口鯰肌細(xì)胞系。
[0008]在上述方法中，所述步驟I)中，每mL水溶液中，青霉素和鏈霉素含量的比例為
I: I ?3。
[0009]在上述方法中，所述AM培養(yǎng)基為含有500U/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素、12.5 μ g/mL兩性霉素B和250 μ g/mL慶大霉素的2 X MEM培養(yǎng)基。
[0010]在上述方法中，所述南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液配方是以MEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加了 20%胎牛血清、0.2 μ g/mL表皮生長(zhǎng)因子和25ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子，培養(yǎng)液的pH為7.2?7.4
[0011]在適合的條件下南方大口鯰肌細(xì)胞系可以進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)的步驟:
[0012]I)南方大口鯰肌細(xì)胞系待南方大口鯰肌肉細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并將舊培養(yǎng)液離心，然后向培養(yǎng)瓶中加入2?3mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶溶液；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待80%細(xì)胞收縮變圓時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基上清液來(lái)中和胰蛋白酶，并用移液管反復(fù)吹打細(xì)胞瓶底，使細(xì)胞分散制成細(xì)胞懸液；
[0013]2)將步驟I)制備得到的細(xì)胞懸液在1000?2000轉(zhuǎn)/min條件下離心7min，用
6?8mL南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并分裝于2個(gè)培養(yǎng)瓶中，最后向每個(gè)培養(yǎng)瓶補(bǔ)加2?3mL舊培養(yǎng)液上清液，待南方大口鯰肌肉條細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0014]本發(fā)明構(gòu)建的南方大口鯰肌細(xì)胞系現(xiàn)已傳至第56代。在條件合適情況下可以無(wú)限傳代。
[0015]本發(fā)明的有益效果在于:
[0016]1、本發(fā)明的細(xì)胞系具有連續(xù)傳代特點(diǎn)，能提供大量的南方大口鯰肌肉細(xì)胞；可直接應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)以及相關(guān)基礎(chǔ)研究。
[0017]2、組織塊消毒滅菌效果好。由于南方大口鯰活魚(yú)體組織表面有大量的細(xì)菌和真菌，組織塊消毒滅菌的效果是決定組織細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。用上述AIM培養(yǎng)基浸泡的方法來(lái)進(jìn)行消毒滅菌，既可有效地殺滅組織表面的細(xì)菌和真菌，又可以避免對(duì)組織的損傷，最大限度地保持組織的活力。
[0018]3、組織塊貼壁生長(zhǎng)良好。
[0019]4、本發(fā)明操作簡(jiǎn)便易行，無(wú)需特殊設(shè)備，在一般的無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)均可操作。

【具體實(shí)施方式】
[0020]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0021]實(shí)施例1
[0022]南方大口鯰肌肉組織塊的制備:將南方大口鯰在加入了濃度為1000單位/mL的青霉素和鏈霉素的水中暫養(yǎng)48h，取出南方大口鯰置于體積分?jǐn)?shù)為75%酒精中浸泡2min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用手術(shù)剪剪下背部肌肉組織，于AM培養(yǎng)基中浸泡，期間30min更換一次AM培養(yǎng)基，浸泡2h后，用眼科剪將肌肉組織剪碎成Imm3的小塊，然后用AM培養(yǎng)基沖洗2次，收集大約20個(gè)組織小塊貼到25cm2的涂有貼壁物質(zhì)的原代細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，在室溫下干貼2h使接種的組織塊貼壁牢固。
[0023]AM培養(yǎng)基為含有500U/mL青霉素、500μ g/mL鏈霉素、12.5μ g/mL兩性霉素B和250 μ g/mL慶大霉素的2XMEM培養(yǎng)基。南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液是MEM培養(yǎng)基，其中添加了 20%胎牛血清、0.2 μ g/mL表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)和25ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子(Sigma)，培養(yǎng)液的pH為7.2?7.4。
[0024]在培養(yǎng)箱中干貼2個(gè)小時(shí)后,將培養(yǎng)瓶側(cè)放半小時(shí),然后吸出過(guò)多的培養(yǎng)液,最后緩慢注入4mL南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液，在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)情況，每隔2天用移液管吸出舊的培養(yǎng)基，3000r/min離心5min，吸出2.5mL上清液再加上2.5mL新鮮南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液。待南方大口鯰肌肉細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并將舊培養(yǎng)液3000r/min離心5min，然后向培養(yǎng)瓶中加入2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待80%細(xì)胞收縮變圓時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基上清液來(lái)中和胰蛋白酶，用移液管反復(fù)吹打細(xì)胞瓶底，使細(xì)胞分散制成細(xì)胞懸液；然后將此細(xì)胞懸液1000轉(zhuǎn)/min離心7min，用6mL新鮮南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并分裝于2個(gè)培養(yǎng)瓶，最后向每個(gè)培養(yǎng)瓶補(bǔ)加2mL舊培養(yǎng)液上清，使最終體積為5mL。待南方大口鯰肌肉條細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0025]實(shí)施例2
[0026]南方大口鯰肌肉組織塊的制備:將南方大口鯰在加入了濃度為1000單位/mL的青霉素和鏈霉素的水中暫養(yǎng)48小時(shí)，取出南方大口鯰置75%酒精中浸泡2min，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用手術(shù)剪剪下背部肌肉組織，于AIM培養(yǎng)基中浸泡，期間每半小時(shí)換一次AIM培養(yǎng)基，浸泡2個(gè)小時(shí)后，用眼科剪將肌肉組織剪碎成Imm3的小塊，然后用AM培養(yǎng)基沖洗2次，收集大約20個(gè)組織小塊貼到25cm2的涂有貼壁物質(zhì)的原代細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，在室溫下干貼4小時(shí)使接種的組織塊貼壁牢固。AIM培養(yǎng)基為含有500U/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素、12.5 μ g/mL兩性霉素B和250 μ g/mL慶大霉素的2XMEM培養(yǎng)基。南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液是MEM培養(yǎng)基，其中添加了 20%胎牛血清、0.2 μ g/mL表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)和25ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子(Sigma),培養(yǎng)液的pH調(diào)至7.2?7.4。
[0027]在培養(yǎng)箱中干貼4個(gè)小時(shí)后,將培養(yǎng)瓶側(cè)放半小時(shí),然后吸出過(guò)多的培養(yǎng)液,最后緩慢注入4mL南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液，在22°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)情況，每隔3天用移液管吸出舊的培養(yǎng)基，3000r/min離心5min，吸出2.5mL上清液再加上2.5mL新鮮南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液。待南方大口鯰肌肉細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并將舊培養(yǎng)液3000r/min離心5min，然后向培養(yǎng)瓶中加入2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待80%細(xì)胞收縮變圓時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基上清來(lái)中和胰酶，用移液管反復(fù)吹打細(xì)胞瓶底，使細(xì)胞分散制成細(xì)胞懸液；然后將此細(xì)胞懸液1000轉(zhuǎn)/min離心7min，用6mL新鮮南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并分裝于2個(gè)培養(yǎng)瓶，最后向每個(gè)培養(yǎng)瓶補(bǔ)加2mL舊培養(yǎng)液上清，使最終體積為5mL。待南方大口鯰肌肉條細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0028]實(shí)施例3
[0029]南方大口鯰肌肉組織塊的制備:將南方大口鯰在加入了濃度為1000單位/mL的青霉素和鏈霉素的水中暫養(yǎng)48小時(shí)，取出南方大口鯰置75%酒精中浸泡Imin，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用手術(shù)剪剪下背部肌肉組織，于AIM培養(yǎng)基中浸泡，期間每半小時(shí)換一次AIM培養(yǎng)基，浸泡2個(gè)小時(shí)后，用眼科剪將肌肉組織剪碎成Imm3的小塊，然后用AM培養(yǎng)基沖洗2次，收集大約20個(gè)組織小塊貼到25cm2的涂有貼壁物質(zhì)的原代細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，在室溫下干貼2小時(shí)使接種的組織塊貼壁牢固。
[0030]AM培養(yǎng)基為含有500U/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素、12.5 μ g/mL兩性霉素B和250 μ g/mL慶大霉素的2XMEM培養(yǎng)基。南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液是MEM培養(yǎng)基，其中添加了 20%胎牛血清、0.2 μ g/mL表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)和25ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子(Sigma)，培養(yǎng)液的pH調(diào)至7.2?7.4。
[0031]在培養(yǎng)箱中干貼2個(gè)小時(shí)后，將培養(yǎng)瓶側(cè)放半小時(shí)，然后吸出過(guò)多的培養(yǎng)液，最后緩慢注入4mL南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液，在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)情況，每隔3天用移液管吸出舊的培養(yǎng)基，3000r/min離心5min，吸出2.5mL上清液再加上2.5mL新鮮南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液。待南方大口鯰肌肉細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，吸出培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，并將舊培養(yǎng)液3000r/min離心5min，然后向培養(yǎng)瓶中加入2mL濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液；在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待80%細(xì)胞收縮變圓時(shí)，在超凈工作臺(tái)內(nèi)加入南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基上清來(lái)中和胰酶，用移液管反復(fù)吹打細(xì)胞瓶底，使細(xì)胞分散制成細(xì)胞懸液；然后將此細(xì)胞懸液1000轉(zhuǎn)/min離心7min，用6mL新鮮南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，并分裝于2個(gè)培養(yǎng)瓶，最后向每個(gè)培養(yǎng)瓶補(bǔ)加2mL舊培養(yǎng)液上清，使最終體積為5mL。待南方大口鯰肌肉條細(xì)胞再次長(zhǎng)成單層后，仍以上述的相同方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
[0032]其它未詳細(xì)說(shuō)明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng)創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)首先將體質(zhì)健康的南方大口鯰置于含有濃度為1000單位/mL的青霉素和鏈霉素的水溶液中飼養(yǎng)36?60h， 2)取出南方大口鯰置于體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中浸泡I?2min后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌剪下背肌，并將背肌置于AM培養(yǎng)基中浸泡2?3h，其中，25?35min更換一次AIM培養(yǎng)基， 3)將步驟2)浸泡的背肌用眼科剪剪碎成Imm3的小塊，然后用AM培養(yǎng)基沖洗2?3次，收集20?25個(gè)組織小塊貼到25cm2的原代細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，在室溫下干貼2?4h后，將培養(yǎng)瓶側(cè)放半小時(shí)后，吸出過(guò)多的培養(yǎng)液，每個(gè)培養(yǎng)瓶中緩慢注入4?6mL升的南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液，在22?25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄培養(yǎng)情況，每隔2?3天用移液管吸出舊的培養(yǎng)基，并離心，然后吸出2?3mL的上清液再加上2?3mL的南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液；即得到南方大口鯰肌細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟I)中，每ImL水溶液中，青霉素和鏈霉素含量的比例為1:1?3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于:所述AIM培養(yǎng)基為含有500U/mL青霉素、500 μ g/mL鏈霉素、12.5 μ g/mL兩性霉素B和250 μ g/mL慶大霉素的2 X MEM培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述南方大口鯰肌細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征在于:所述南方大口鯰肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液配方是以MEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加了 20%胎牛血清、0.2 μ g/mL表皮生長(zhǎng)因子和25ng/mL成纖維生長(zhǎng)因子，培養(yǎng)液的pH為7.2?7.4。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK104403994SQ201410729274
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】湯蓉, 王敏, 魯元安, 李大鵬 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)