一種用于檢測pik3ca基因突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明適用于生物技術(shù)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種PIK3CA基因突變檢測試劑盒。本發(fā)明的第1-5號試劑依次針對PIK3CA基因的E542K、E545K、E545D、H1047R和H1047L突變，第6號試劑針對PIK3CA基因的保守區(qū)，用作質(zhì)控，檢測方法利用上述檢測試劑盒通過熒光定量PCR反應(yīng)進行。本發(fā)明實施例提供的檢測試劑盒靈敏度高，特異性好，是一種性能優(yōu)良的人類PIK3CA基因突變檢測試劑盒。本發(fā)明采用熒光定量PCR方法對PIK3CA基因突變區(qū)域序列進行特異性擴增檢測，同時利用MGB阻斷核酸與待測樣品中野生型DNA模板特異結(jié)合，抑制該野生型DNA模板與引物探針的結(jié)合。采用了降低引物Tm值、5’端加尾和在引物中間加入插入堿基等方法設(shè)計正向引物，提高試劑盒特異性，再引入45個以上的循環(huán)數(shù)，從而達到提高試劑盒靈敏度的效果。
【專利說明】-種用于檢測PIK3CA基因突變的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種人類PIK3CA基因突變檢測試 劑盒及檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] PI3K(Phosphatidylinositol-3_Kinase，磷脂酰肌醇 3 激酶）是一種細胞內(nèi)磷脂 酰肌醇激酶，由一個110k Da的催化亞基pllO和一個85k Da的調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成。其中 PIK3CA(phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate3-kinase, catalytic subunit alpha, 磷脂酰肌醇3' -激酶催化亞基a )是PI3K家族IA型PI3K的pllO α催化亞基。PI3K在 人體正常腦、肺、乳腺、胃腸、宮頸和卵巢等組織中均有表達，具有調(diào)控機體細胞增殖、存活、 死亡和分化等重要生理功能。正常情況下，PI3K可產(chǎn)生3, 4-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2) 和3, 4, 5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3)，PIP2和PIP3可作為第二信使抑制/激活下游 AKT(Protein kinase B)通路中的各種祀蛋白分子，控制信號的傳導(dǎo)和級聯(lián)放大，從而調(diào)節(jié) 細胞的增殖、分化和遷移。
[0003] 有研究證實，在腫瘤患者中，PIK3CA基因突變可以激活PI3K通路的下游AKT通 路，增加細胞浸潤和轉(zhuǎn)移，促進體細胞癌變，加速腫瘤患者病情惡化。該基因的突變可發(fā)生 于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等多種癌癥中，在乳腺癌和結(jié)直腸癌中的突變率分別為26%和 25%。突變主要集中在9號外顯子和20號外顯子上，最常見的5個突變?yōu)椋篍542K、E545K、 E545D、H1047R和H1047L，約占總突變的90%以上。
[0004] 表1 :人類PIK3CA基因5種突變
[0005]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測受試者中PIK3CA基因突變的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括 分開設(shè)置的第1-6號試劑，并且： a. 第1號試劑包含序列為SEQ ID NO: 1的正向引物、序列為SEQ ID NO:2的反向引物 和探針A ; b. 第2號試劑包含序列為SEQ ID N0:4的正向引物、序列為SEQ ID N0:2的反向引物 和探針A ; c. 第3號試劑包含序列為SEQ ID NO: 5的正向引物、序列為SEQ ID NO: 2的反向引物、 探針A和MGB阻斷核酸C ; d. 第4號試劑包含序列為SEQ ID N0:7的正向引物、序列為SEQ ID N0:8的反向引物 和探針B ;
6.第5號試劑包含序列為5￡〇10勵:10的正向引物、序列為5￡〇10勵:8的反向引物 和探針B ; f.第6號試劑包含序列為SEQ ID NO: 11的正向引物、序列為SEQ ID NO: 2的反向引物 和探針A ; 其中探針A由序列為SEQ ID N0:3的核酸、該核酸的5'端連接的熒光報告基團和該核 酸的3'端連接的熒光淬滅基團組成； 探針B由序列為SEQ ID N0:9的核酸、該核酸的5'端連接的熒光報告基團和該核酸的 3'端連接的熒光淬滅基團組成； 所述的MGB阻斷核酸C的核酸序列為SEQ ID N0:6,其包括MGB基團修飾，且3'端脫氧 核糖核苷酸骨架上的3'羥基被封閉； 優(yōu)選地，所述的受試者是人類癌癥患者； 進一步優(yōu)選地，所述的受試者是采用了 PI3K抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑（TKIs)等PI3K 通路相關(guān)靶向藥物治療的人類癌癥患者。
2. 權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于： 所述的第1號試劑中，序列為SEQ ID N0:1的正向引物、序列為SEQ ID N0:2的反向引 物和探針 A 的摩爾比為 0. 2 ii M-l ii M :0. 2 ii M-l ii M :0. 1 ii M-0. 5 ii M ; 所述的第2號試劑中，序列為SEQ ID N0:4的正向引物、序列為SEQ ID N0:2的反向引 物和探針 A 的摩爾比為 0. 2 ii M-l ii M :0. 2 ii M-l ii M :0. 1 ii M-0. 5 ii M ; 所述的第3號試劑中，序列為SEQ ID N0:5的正向引物、序列為SEQ ID N0:2的反向 引物、探針 A 和 MGB 阻斷核酸 C 的摩爾比為 0. :0. :0. liiM-0. 5iiM : 0. 8 u M-4 u M ； 所述的第4號試劑中，序列為SEQ ID N0:7的正向引物、序列為SEQ ID N0:8的反向引 物和探針 B 的摩爾比為 0. 2 ii M-l ii M :0. 2 ii M-l ii M :0. 1 ii M-0. 5 ii M ; 所述的第5號試劑中，序列為SEQ ID NO: 10的正向引物、序列為SEQ ID N0:8的反向 引物和探針 B 的摩爾比為 0? 2 ii M-l ii M :0? 2 ii M-l ii M :0? 1 ii M-0. 5 ii M ; 所述的第6號試劑中，序列為SEQ ID NO: 11的正向引物、序列為SEQ ID N0:2的反向 引物和探針 A 的摩爾比為 0. 2 ii M-l ii M :0. 2 ii M-l ii M :0. 1 ii M-0. 5 ii M。
3. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，在所述探針A和探針B中，所述的熒光 報告基團選自？八1^1(：、1?(?、冊乂、0￥3、0￥5和波長范圍相似的其它熒光報告基團；所述熒光 淬滅基團選自TAMRA、BHQ1、BHQ2和NFQ，并且熒光報告基團與熒光報告基團的搭配根據(jù)熒 光能量共振轉(zhuǎn)移原理來選擇； 優(yōu)選地，所述的探針A和探針B的3'端熒光淬滅基團是MGB-NFQ。
4. 權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第1-6號試劑中還分別包含PCR緩 沖液、ROX參比染料和Taq酶的一種或多種； 優(yōu)選地，所述的 PCR 緩沖液包含 Tris-HCl、（NH)2S04、MgCl2、Tween 20 和 dNTPs ; 進一步優(yōu)選地，所述的Tris-HCl、（NH)2S04、MgCl2、Tween 20和dNTPs的濃度分別為 50-100mM、5-30mM、l-8mM、5% -15%、和 100-200 iiM。
5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖液包含PCR添加劑； 優(yōu)選地，所述的PCR添加劑為DMSO、甜菜堿、BSA、甲酰胺或甘油。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第1-6號試劑中包含由dATP、 dUTP、dCTP和dGTP構(gòu)成的dNTPs混合液和UNG酶形成的抗污染系統(tǒng)； 優(yōu)選地,所述的dATP、dUTP、dCTP和dGTP物質(zhì)的量的比例為0. ImM-O. 5Mm ;0. ; 0. lmM-0. 5mM ;0. lmM-0. 5mM。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第1-5號試劑中分別包含根據(jù)特 定基因序列設(shè)計的內(nèi)標(biāo)引物探針； 優(yōu)選地，所述內(nèi)標(biāo)引物探針的核酸序列分別為3￡〇10勵：12、5￡〇10勵：13和5￡〇10 NO:14 ； 進一步優(yōu)選地，核酸序列為SEQ ID NO: 14的內(nèi)標(biāo)探針的5'端連接有熒光報告基團、3' 端連接有熒光淬滅基團； 更優(yōu)選地，核酸序列為SEQ ID NO: 14的內(nèi)標(biāo)探針的熒光報告基團為VIC，熒光淬滅基團 為 TAMRA。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第3號試劑中的MGB阻斷核酸C 的3 '羥基采用的是MGB-NFQ封閉。
9. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第3號試劑中的MGB阻斷核酸C 中的MGB修飾可以存在于不同位置；優(yōu)選地，所述的MGB修飾是5'端修飾、3'端修飾或其 位于核酸的中間部位等對試劑性能無較大改善的修飾位置。
10. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述第3號試劑中的MGB阻斷核酸 C還包括增加并變換修飾基團但對試劑性能無較大改善的其它修飾； 優(yōu)選地，所述的其他修飾選自磷酸化修飾、熒光報告基團修飾、熒光淬滅基團修飾和鎖 核酸修飾。
11. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶混合液、空白對 照、弱陽性質(zhì)控、強陽性質(zhì)控、點樣用指示劑或樣品稀釋液的一種或多種。
12. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括核酸提取試劑。
13. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括第7號試劑，該第 7號試劑是酶混合液； 優(yōu)選的，所述的酶混合液由熱啟動Taq酶、UNG酶和甘油組成。
14. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括第8號試劑，該第 8號試劑是空白對照； 優(yōu)選地，所述的空白對照是pH為8. 0的lOmM Tris-HCl。
15.如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括第9號試劑，該第 9號試劑是弱陽性對照試劑； 優(yōu)選地，該弱陽性對照試劑是含有PIK3CA基因E542K、E545K、E545D、H1047R、H1047L 的5種突變類型質(zhì)粒和內(nèi)標(biāo)質(zhì)粒的混合液。
【文檔編號】C12Q1/68GK104372102SQ201410734805
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】蔡從利, 董瑞華, 彭盼, 張喆, 周鵬飛 申請人:武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司