基于二溫式rt-pcr檢測h4亞型禽流感病毒的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒，該試劑盒含有一對特異性引物。實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用本發(fā)明可檢測H4亞型禽流感病毒，具有操作快速簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示該法可特異性擴(kuò)增出H4亞型禽流感病毒，不擴(kuò)增其他常見禽病病原體；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示該法對H4亞型禽流感病毒檢測下限為1.48pg/μL；對86份臨床樣品進(jìn)行檢測，臨床樣品檢測結(jié)果與病毒分離結(jié)果一致。本發(fā)明用于H4亞型禽流感病毒導(dǎo)致的禽類感染早期診斷及有效防制，可以節(jié)約時間的成本。
【專利說明】基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于PCR檢測病毒【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽 流感病毒的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avian Inf luenza，Al)是由正黏病毒科A型流感病毒屬的禽流感 病毒（AIV)引起的一種禽類的感染和/或疾病綜合征，主要引起禽類的全身或呼吸系 統(tǒng)疾病。AIV亞型眾多，根據(jù)表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶 (Neuraminidase, NA)的抗原性差異，已鑒別出16種HA亞型（H1-H16)和9種NA(N1-N9) 亞型；根據(jù)AIV致病力的差異可分為高致病性禽流感病毒（Highly Pathogenic Avian Influenza Virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒（Lowly Pathogenic Avian Influenza Virus，LPAIV)。HPAIV引起家禽的Al以全身感染、高發(fā)病率和高死亡率為特征；LPAIV引起 家禽AI的臨床癥狀表現(xiàn)溫和，死亡率不高，但影響家禽的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能。
[0003] H4亞型AIV屬于LPAIV，能隱性感染各種家禽及野生鳥類，宿主范圍比較廣，包 括雞、火雞、鴨、野鴨、野鳥、鴕鳥、鸚鵡等，還可以跨種傳播，感染哺乳動物。薛峰等報(bào)道， 在江蘇鹽城國家級自然保護(hù)區(qū)對野鴨、丹頂鶴等野禽AIV檢測中，H4亞型AIV分離率最高 (38. 5% )。雖然絕大多數(shù)LPAIV致病力低，但LPAIV可能為感染人類的AIV提供基因，潛在 危害性不容忽視。因此，應(yīng)加強(qiáng)對H4亞型AIV的監(jiān)測。目前，國內(nèi)已建立的快速檢測方法 多數(shù)都是針對其他亞型AIV，如Hl、H3、H5、H6、H7、H9亞型，而針對H4亞型AIV的快速檢測 方法的未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供敏感性好、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的基于二溫式 RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒，以簡便快速地檢測H4亞型禽流感病毒。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：H4亞型禽流感病毒二溫式 RT-PCR檢測引物對，包括引物1和2,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和SEQ. ID. No. 2的 堿基序列。
[0006] 引物1和引物2的摩爾比為1 : 1。
[0007] 上述H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng)用，PCR擴(kuò) 增的退火溫度為58. (TC -68. (TC。
[0008] PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
[0009] 基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒，包括引物對、PCR擴(kuò)增緩沖 液和水；
[0010] 引物對包括引物1和2,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和SEQ. ID. No. 2的堿基 序列，其濃度均為25pmol/ μ L，在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0· 5pmol/ μ L ;
[0011] PCR 擴(kuò)增緩沖液為 2 X Taq PCR Mix。
[0012] 引物1和2在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0. 5 μmol/L。
[0013] 上述基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng) 用，PCR擴(kuò)增的退火溫度為58. (TC -68. (TC。
[0014] PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
[0015] 針對目前缺乏對H4亞型禽流感病毒進(jìn)行快速檢測和診斷的有效可靠的技術(shù)，發(fā) 明人研宄設(shè)計(jì)了一對特異性引物，據(jù)此建立了 H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測方法， 并制備了相應(yīng)的檢測試劑盒。實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用本發(fā)明可檢測H4亞型禽流感病毒，具有操作 快速簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示該法可特異性擴(kuò)增 出H4亞型禽流感病毒，不擴(kuò)增其他常見禽病病原體；敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示該法對H4亞型禽 流感病毒檢測下限為I. 48pg/ μ L ;對86份臨床樣品進(jìn)行檢測，臨床樣品檢測結(jié)果與病毒分 離結(jié)果一致。本發(fā)明用于Η4亞型禽流感病毒導(dǎo)致的禽類感染早期診斷及有效防制，可以節(jié) 約時間的成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是二溫式RT-PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果電泳圖，圖中：M、DL1000 DNA Marker ;1、 58°C ;2、59°C ;3、60°C ;4、61°C ;5、62°C ;6、63°C ;7、64°C ;8、65°C ;9、66°C ;10、67°C ;11、68°C ; 12、陰性對照。
[0017] 圖2是二溫式RT-PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中：M、DL1000 DNA Marker ;1? 3為3株不同的H4亞型禽流感病毒；4?9分別為H1、H3、H5、H6、H7、H9亞型AIV ;10、NDV ; 11、IBV ;12、ILTV ;13、MG ;14、ARV ;15、陰性對照。
[0018] 圖3是二溫式RT-PCR的敏感性試驗(yàn)結(jié)果電泳圖，圖中：M. DL1000 DNA Marker ;1、 14. 8ng/μ L ;2、I. 48ng/μ L ;3、148pg/μ L ;4、14. 8pg/μ L ;5、I.48pg/μ L ;6、148fg/μ L ; 7、14.8fg/yL;8、陰性對照。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。具體所用材料和試劑如下：
[0020] 1、H4N2 亞型 AIV(A/duck/Guangxi/12roi7/2012(H4N2))序列信息收錄于 NCBI 基 因庫，登錄號為KJ881013-KJ881020
[0021] 2、H4N5 亞型 AIV(A/Duck/HK/668/79(H4N5))記載于
[0022] Zhixun Xie, Ya〇-shan Pang, Jiabo Liu, et al. A multiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiation of avian H5, H7, and H9 hemagglutinin subtypes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2006, 20 (3-4):245-249
[0023] 3、H4 亞型 AIV (A/Duck/Guangxi/027D/09 (H4))記載于
[0024] 彭宜，謝芝勛，劉加波，等.禽流感病毒RT-LAMP檢測技術(shù)的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn) 展，2012, 33(12) :43 - 46.
[0025] 4、H1N2 亞型 AIV (A/Sparrow/Guangxi/GXs-1/2012 (H1N2))記載于
[0026] 郭捷，謝芝勛，彭宜，等.一株鳥源H1N2型禽流感病毒全基因序列分析[J].中 國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014, 34(6) :874-820
[0027] 5、H3N2 亞型 AIV (A/Duck/Guangxi/N42/2009 (H3N2))記載于
[0028] Peng Yl, Xie Z, Liu J, et al. Visual detection of H3 subtype avian influenza viruses by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Virology Journal, 2011, 8:337
[0029] 6、H5N2 亞型 AIV (A/Turkey/GA/209092/02 (H5N2))記載于
[0030] 彭宜，謝芝勛，劉加波，等.H5亞型禽流感病毒RT-LAMP可視化檢測技術(shù)的建立 [J]·南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013, 02:323-327.
[0031] 7、H6N2 亞型 AIV(A/duck/Guangxi/GXd-3/2009(H6N2))記載于
[0032] Peng Y, Xie Z, Liu J, et al. Epidemiological Surveillance of Low Pathogenic Avian Influenza Virus (LPAIV) from Poultry in Guangxi Province, Southern China. [J]. PLOS ONE, 2013, 8(10):1-6.
[0033] 8、H7N2 亞型 AIV (A/Chicken/NY/273874/03 (H7N2))記載于
[0034] 謝芝勛，龐耀珊，鄧顯文，等.H5和H7亞型禽流感病毒多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng)快速檢測及鑒別方法的建立[J].
[0035] 9、H9N2 亞型 AIV (A/turtledove/Guangxi/49B6/2013 (H9N2))記載于
[0036] Xu Q，Xie Z X，Xie L J，et al. Characterization of an Avian Influenza Virus H9N2 Strain Isolated from a Wild Bird in Southern China[J]. Genome Announc. 2014Jun 19 ；2 (3). pii:e00600-14. doi:10. 1128/genomeA. 00600-14.
[0037] 10、新城疫病毒（Iasota)、傳染性支氣管炎病毒（M41)、雞毒支原體（MG S6)、記載 于
[0038] 彭宜，謝芝勛，郭捷，等.利用RT-LAMP可視化檢測技術(shù)檢測Hl亞型禽流感病 毒及Nl、N2亞型的分型"，病毒學(xué)報(bào)，2013, 29 (2) : 154-159
[0039] 11、雞傳染性喉氣管炎病毒（AV1231)記載于
[0040] Xie Z, Luo S,Xie L, et al. Simultaneous typing of nine avian respiratory pathogens using a novel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay[J]. J Virol Methods. 2014 12 ;207C:188-195.
[0041] 12、禽呼腸孤病毒雞毒（S1133)記載于
[0042] Xie Z, Luo S,Xie L, et al. Simultaneous typing of nine avian respiratory pathogens using a novel GeXP analyzer-based multiplex PCR assay[J]. J Virol Methods. 2014 12 ;207C:188-195.
[0043] 病毒DNA/RNA抽提試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為 ER201-01。
[0044] AMV反轉(zhuǎn)錄酶、5XAMV Buffer均購自寶生物工程（大連）有限公司，產(chǎn)品目錄號 為 2621。
[0045] dNTP，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號：4019。
[0046] 2 X Tap PCR Mix，大連寶生物工程有限公司，產(chǎn)品目錄號：RR901A。
[0047] 實(shí)施例1、引物的設(shè)計(jì)與合成
[0048] 根據(jù)H4亞型禽流感病毒的HA基因核苷酸序列的保守區(qū)域，應(yīng)用生物軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并篩選了 1對特異性引物，見表1。其中，引物擴(kuò)增目的片段為336bp。引 物由Invitrogen公司合成。
[0049] 表1引物序列
[0050]

【權(quán)利要求】
1. H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對，其特征在于包括引物1和2,它們分 別具有序列表SEQ. ID. No. 1和SEQ. ID. No. 2的堿基序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對，其特征在于： 所述引物1和引物2的摩爾比為1 : 1。
3. 權(quán)利要求2所述H4亞型禽流感病毒二溫式RT-PCR檢測引物對在PCR擴(kuò)增方面的應(yīng) 用，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為58. 0°C -68. 0°C。
4. 權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
5. -種基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒，其特征在于包括引物對、 PCR擴(kuò)增緩沖液和水； 所述引物對包括引物1和2,它們分別具有序列表SEQ. ID. No. 1和SEQ. ID. No. 2的堿基 序列，其濃度均為25pmol/ y L，在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0? 5pmol/ y L ; 所述PCR擴(kuò)增緩沖液為2 XTaq PCR Mix。
6. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒，其特 征在于：所述引物1和2在PCR反應(yīng)體系中的終濃度分別為0. 5 y mol/L。
7. 權(quán)利要求7所述基于二溫式RT-PCR檢測H4亞型禽流感病毒的試劑盒在PCR擴(kuò)增方 面的應(yīng)用，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為58. 0°C -68. 0°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為65°C。
【文檔編號】C12N15/11GK104498624SQ201410734872
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】謝芝勛, 吳嬡瓊, 謝志勤, 鄧顯文, 劉加波, 謝麗基, 羅思思, 黃莉, 黃嬌玲, 曾婷婷 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所