一種禽流感h5n6亞型的雙色熒光定量pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明檢測試劑盒含有特異性引物和探針，通過反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化，一次試驗(yàn)可同時(shí)高靈敏、高特異地檢測出H5N6的H5基因和N6基因，具有很好的特異性、敏感性和重復(fù)性；可特異性地檢測H5N6，與SIV-H1N1、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2等病毒的不發(fā)生交叉反應(yīng)；檢測限達(dá)102拷貝/μl；重復(fù)性較好；本發(fā)明的檢測方法是H5N6亞型禽流感病毒快速初篩及初步確認(rèn)定型的良好方法。
【專利說明】一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]禽流感是由正黏病毒科流感病毒屬A型病毒(AIV)引起的一種禽類感染或疾病綜合征。禽流感的發(fā)病情況取決于病毒的致病性及一級宿主的易感性，也受環(huán)境因素、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件及并發(fā)疾病等因素的影響，可表現(xiàn)為無癥狀感染、輕度上呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋量下降及急性的致病性死亡。
[0003]根據(jù)血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，禽流感病毒分為不同的亞型。迄今為止，HA已發(fā)現(xiàn)16種，NA已發(fā)現(xiàn)9種。
[0004]H5亞型中，常見的H5N1、H5N2亞型為高致病性禽流感，而H5N6在以往一直被認(rèn)為是低致病性的禽流感。2014年5月9日，在不明原因肺炎的監(jiān)測中，在一個因重癥肺炎去世的病例標(biāo)本中監(jiān)測出H5N6禽流感病毒核酸陽性，經(jīng)過中國疾控中心進(jìn)一步確認(rèn)為H5N6禽流感病毒。而后這次根據(jù)病毒基因的序列分析，最后證明它對禽是高致病性的。盡管這是個案，H5N6感染人的風(fēng)險(xiǎn)并不是很高，但是動物疫病監(jiān)控機(jī)構(gòu)和疾控機(jī)構(gòu)還是需要對其具備足夠的重視。
[0005]基于Taqman探針法的一步法突光定量實(shí)時(shí)PCR ( Realtime FluorescenceRT-PCR)可以快速、靈敏、特異地檢出目的RNA片段，已經(jīng)逐漸成為RNA病毒檢測的一個重要發(fā)展方向。通過實(shí)時(shí)記錄探針標(biāo)記基團(tuán)受激發(fā)產(chǎn)生的熒光，實(shí)現(xiàn)了對PCR擴(kuò)增過程實(shí)時(shí)監(jiān)測，無需電泳檢測，有效減少了 PCR產(chǎn)物的氣溶膠污染和EB對環(huán)境的污染。而配合適當(dāng)?shù)腷uffer、引物、探針，可以使靈敏度達(dá)到低至10個以內(nèi)拷貝的檢測。
[0006]多色熒光定量PCR技術(shù)是指在同一個熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中同時(shí)擴(kuò)增多個目的基因，而每個目的基因采用的不用波長的熒光探針進(jìn)行檢測。熒光標(biāo)記的探針有多種，比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每種熒光標(biāo)記的探針在PCR擴(kuò)增過程中所產(chǎn)生的熒光信號不同。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種禽流感病毒H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種禽流感病毒H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測方法。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:病毒RNA核酸提取液、酶混合液、雙色熒光定量PCR Mix、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，所述雙色熒光定量PCRMix中含有2 X雙色熒光定量PCR buffer、dNTPs、及禽流感病毒H5N6亞型的H5基因和N6基因的特異性引物及探針，序列分別為:
H5基因的
上游引物:H5-F:5’ - CACATGCTCAGGACATACTGGA-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:H5-R:5，- ACACATTGGGTTTCCGAGGA-3’ (SEQ ID N0.2)；
熒光探針:H5-P:5’ -Fam-AGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATC-3’ BHQl (SEQ ID N0.3)；
N6基因的
上游引物:N6-F:5’ -TATGTAGAACTAATCAGAGGGAGGCC-3’ (SEQ ID N0.4),
下游引物:N6-R:5，-CCGTCATGCCAGGACCA-3，(SEQ ID N0.5),
熒光探針:N6-P:5’ -CY5-GTAGCACTCTGTGGATCCAAGGAGCGATT-3’ BHQ2 (SEQ ID N0.6)；H5基因的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為Fam，淬滅基團(tuán)為BHQl ；N6基因的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQ2。
[0010]進(jìn)一步的，上述2 X雙色熒光定量PCR buffer含有pH為7.8的64mM HEPES、8mMMgCl2UOOmM KC1、4%DMS0、0.2mM 甜菜堿、0.2mg/mL 海藻糖。
[0011]進(jìn)一步的，上述病毒RNA提取液中每2L中含有異硫氰酸胍250g，重蒸苯酚500ml，10%十二烷基肌氨酸鈉溶液26.4mL, 0.75M檸檬酸鈉溶液17.6mL, 2M醋酸鈉溶液50mL，余量為雙蒸水，pH值為4.8?5.2。
[0012]進(jìn)一步的,上述酶混合液中含有Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0013]一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟:
1)提取病毒RNA；
2)雙色熒光定量PCR擴(kuò)增:將雙色熒光定量PCRMix 20μ1中加入酶混合液?μ?，瞬時(shí)離心混勻后，再加入病毒RNA 4μ1 ;放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測的名稱和熒光基團(tuán)種類，設(shè)定循環(huán)條件:42°C 20分鐘；95°C 10分鐘；95°C 10秒，58°C 20秒，采集熒光信號，40個循環(huán)；
3)結(jié)果分析:根據(jù)信噪情況設(shè)定和調(diào)整基線和閾值，通過收集的熒光曲線和CT值判定結(jié)果;
①陽性:當(dāng)陰性對照無擴(kuò)增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時(shí)，檢測樣本的Ct值(35.0且曲線有明顯的指數(shù)增長期時(shí)，樣本判為陽性；
②可疑:檢測樣本Ct值大于35.0且小于40.0,重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；
③陰性:當(dāng)陰性對照無擴(kuò)增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時(shí)，檢測樣本無Ct值且曲線無明顯的指數(shù)增長期時(shí)，樣本判為陰性。
[0014]進(jìn)一步的，上述雙色熒光定量PCR Mix含有以下成份:
2 X雙色熒光定量PCR buffer12.5μ1
H5-F (ΙΟμΜ)?μ?
H5-R (ΙΟμΜ)?μ?
N6-F (ΙΟμΜ)?μ?
N6-R (ΙΟμΜ)?μ?
Η5-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1
Ν6-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1 dNTPs (1mM)?μ?
ddH20 (Rnase free)補(bǔ)足 20μ1。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
I)本發(fā)明方法通過對所設(shè)計(jì)的引物和探針做大量的實(shí)驗(yàn)篩選，篩選出一組能夠同時(shí)高靈敏、高特異地檢測出待測標(biāo)本中禽流感病毒H5N6的H5基因和N6基因。由于本發(fā)明方法引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，從而避免了其他檢測方法特異性不高容易漏診和誤診的問題。同時(shí)，本發(fā)明試劑盒為根據(jù)本發(fā)明方法原理制得的試劑盒，可方便地同時(shí)檢測出禽流感病毒H5N6的HA基因和NA基因，準(zhǔn)確率高。因此該試劑盒具有廣泛的應(yīng)用前景，適合在各級動物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)、疾病控制單位等大規(guī)模篩查的推廣應(yīng)用。
[0016]2)本發(fā)明建立的H5N6亞型禽流感病毒雙色熒光定量PCR檢測方法具有特異、敏感、重復(fù)性好、快速、費(fèi)用低廉，一次試驗(yàn)即可完成H5N6亞型禽流感病毒H5基因和N6基因的檢測等優(yōu)點(diǎn)，是H5N6亞型禽流感病毒快速初篩及初步確認(rèn)定型的良好方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為雙色熒光PCR體系中禽流感病毒H5基因檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為 I X 108、I X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X 12拷貝 /μι 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果；
圖2為雙色熒光PCR體系中禽流感病毒Ν6基因檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為
IX 108、I X 107、I X 16、I X 105、I X 14、I X 103、I X 12拷貝 /μι 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果；
圖3為雙色方法PCR體系中禽流感病毒Η5基因檢測的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AIV-H5N1(右側(cè)的曲線)、AIV-H5N6標(biāo)本(左側(cè)的曲線)為陽性，SIV-HlNl、NDV, AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2及不含有病毒的陰性對照品為陰性；
圖4為雙色方法PCR體系中禽流感病毒Ν6基因檢測的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AIV-H5N6為陽性，AIV-H5N1、SIV-HlNl、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2 及不含有病毒的陰性對照品為陰性。

【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0019]實(shí)施例1檢測禽流感Η5Ν6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒 (I)特異性引物及探針
本發(fā)明根據(jù)禽流感病毒(Avian influenza virus) H1~H16、N1~N9的核酸序列，分別設(shè)計(jì)用于檢測禽流感病毒H5基因、N6基因的引物和探針；本發(fā)明通過對所設(shè)計(jì)的引物和探針做大量的實(shí)驗(yàn)篩選，篩選出一組同時(shí)對H5N6的H5基因和N6基因具有高靈敏性和高特異性的引物和探針序列，其序列如下:
H5基因的
上游引物:H5-F:5’ - CACATGCTCAGGACATACTGGA-3’ (SEQ ID N0.1)；
下游引物:H5-R:5’ - ACACATTGGGTTTCCGAGGA-3’ (SEQ ID N0.2)；
熒光探針:H5-P:5’ -Fam-AGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATC-3’ BHQl (SEQ ID N0.3)，擴(kuò)增片段長度122bp。
[0020]N6基因的
上游引物:N6-F:5’ -TATGTAGAACTAATCAGAGGGAGGCC-3’ (SEQ ID N0.4)；
下游引物:N6-R:5，-CCGTCATGCCAGGACCA-3，(SEQ ID N0.5),
熒光探針:N6-P:5’ -CY5-GTAGCACTCTGTGGATCCAAGGAGCGATT-3’ BHQ2 (SEQ ID N0.6),擴(kuò)增片段長度116bp。
[0021 ] 用于檢測H5基因的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為Fam，淬滅基團(tuán)為BHQl ;用于檢測N6基因的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQ2。
[0022](2)禽流感病毒H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:
禽流感病毒H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:
I)雙色熒光定量PCR Mix:
雙色熒光定量PCRMix中含有:
2X雙色熒光定量PCR buffer12.5μ1
H5-F (ΙΟμΜ)?μ?
H5-R (ΙΟμΜ)?μ?
N6-F (ΙΟμΜ)?μ?
N6-R (ΙΟμΜ)?μ?
Η5-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1
Ν6-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1
dNTPs (1mM)?μ?
ddH20 (Rnase free)補(bǔ)足 20μ1 ；
其中，2Χ 雙色熒光定量PCR buffer含有64mM HEPES (pH7.8)、8mM MgCl2、10mM KCl、 4%DMS0、0.2mM 甜菜喊、0.2mg/mL 海藻糖。
[0023]2)病毒RNA提取液；
每2L病毒RNA提取液中含有:異硫氰酸胍250g，重蒸苯酚500ml，10%十二烷基肌氨酸鈉溶液26.4mL，0.75M檸檬酸鈉溶液17.6mL，2M醋酸鈉溶液50mL，余量為雙蒸水，pH值為
4.8 ?5.2。
[0024]3)酶混合液:含有Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶；
4)陽性質(zhì)控品:將含有目的基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腺病毒包裝成RNA，經(jīng)RNA提取，測其A260nm和A280nm吸光度值，計(jì)算其濃度并換算成絕對拷貝數(shù)，稀釋成1.0X 17拷貝/ μ 1，作為雙色熒光定量PCR的陽性質(zhì)控品。
[0025]陽性質(zhì)控品的制備:以提取的禽流感Η5Ν6標(biāo)本RNA為模版，進(jìn)行擴(kuò)增，將產(chǎn)物挑取TA克隆，其中PCR擴(kuò)增的步驟如下:
反轉(zhuǎn)錄體系:
Oligo dT Primer (50 μ Μ) I μΙ,?ΝΤΡ Mixture (10 mM ) I μ? 以及總RNA 2μ g,65°C5min,激冷，然后加入 5XPrimeScript Buffer 4M-1 (TAKARA 公司)、RNase Inhibitor (40U/μΙ) 0.5μ1、PrimeScript RTase (200 U/ μ?) ?μ? 和 RNase free H2O 4.5μ1。
[0026]反轉(zhuǎn)錄條件:
30°C 1min,然后42°C，30min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和成cDNA。
[0027]PCR 體系:
1XPCR Buffer 5μ?,TaKaRa Taq (5 υ/μ1)?μ1、dNTP Mixture (各 2.5 πιΜ)4μ1、上述 Η4 和 Η6 上下游引物(10 μ M)各 0.5μ1、上述 cDNA0.5μ1 和 RNase free Η2039.25μ1,
PCR條件:
按照94°C 3分鐘預(yù)變性，94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 45秒，共35個循環(huán)，72°C延伸10分鐘。
[0028]反應(yīng)后取5μ1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測，將切膠純化的PCR產(chǎn)物與載體連接，重組質(zhì)粒涂布于培養(yǎng)皿上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α細(xì)胞，挑取陽性菌落抽提質(zhì)粒。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腺病毒包裝成RNA，作為雙色熒光定量PCR的陽性質(zhì)控品。
[0029]所得陽性質(zhì)控品稀釋之后，經(jīng)RNA提取，測其A260nm和A280nm吸光度值，計(jì)算其濃度并換算成絕對拷貝數(shù)。
[0030]5)陰性質(zhì)控品。
[0031]實(shí)施例2檢測禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR的檢測方法
(I)提取待測樣品中的病毒RNA
I)標(biāo)本采集和預(yù)處理
本發(fā)明方法及試劑盒適用標(biāo)本類型包括禽類的組織、血清、咽拭子、分泌排泄物等。
[0032]組織標(biāo)本:無菌條件下取組織約100?200mg左右，置入1.5ml潔凈EP管中，保存待檢。
[0033]血清:用一次性無菌注射器抽取受檢鳥靜脈血3_5ml，留取血清，保存待檢。
[0034]咽及泄殖腔等拭子:用棉拭子取咽或泄殖腔分泌物，將拭子放入盛有1.0ml PBS的離心管中,立即送檢。
[0035]分泌排泄物:無菌條件下采集，保存待檢。采集的標(biāo)本應(yīng)該盡快送檢，或者保存于-20。。。
[0036]2) RNA 提取
用上述病毒RNA提取液對標(biāo)本進(jìn)彳了核酸提取,步驟為:每300Μ.1標(biāo)本加入700Μ.1 RNA提取液，室溫靜止Imin ;加入200μ1氯仿,振蕩混勻；12000rpm離心5分鐘,吸取上層水相；力口入等體積異丙醇，振蕩混勻；12000rpm離心5分鐘，棄上清；加入ImL 75% DEPC處理水，振蕩混勻；12000rpm離心5分鐘，棄上清；室溫干燥1min后，以適量DEPC處理水溶解(視標(biāo)本濃度和檢測要求，一般為30-50μ1)。
[0037](2 )雙色熒光定量PCR擴(kuò)增
每個測試反應(yīng)體系(25μ1)配制如下，雙色熒光定量PCR Mix 20μ1、酶混合液?μ?，瞬時(shí)離心，然后加入待檢測樣品的RNA 4μ1 ;同樣按照上述體系設(shè)置陽性和陰性對照，加入陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品4μ1進(jìn)行擴(kuò)增。
[0038]將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測的名稱和熒光基團(tuán)種類(檢測Η5的報(bào)告基團(tuán)選擇FAM,檢測Ν6的報(bào)告基團(tuán)選擇CY5,淬滅基團(tuán)選擇none),設(shè)定循環(huán)條件:42°C 20分鐘；95°C 10分鐘；95°C 10秒，58°C 20秒，采集熒光信號，40個循環(huán)。
[0039](3)結(jié)果分析和判定 O結(jié)果分析條件設(shè)定:
①設(shè)置基線(baseline):根據(jù)機(jī)型不同，設(shè)置3_15循環(huán)，6_15循環(huán)，特殊情況可對基線適當(dāng)調(diào)整。
[0040]②設(shè)置閾值(threshold):以閾值線剛超過陰性對照擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最聞點(diǎn)。
[0041]2)結(jié)果判斷
①陽性:當(dāng)陰性對照無擴(kuò)增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時(shí)，檢測樣本的Ct值(35.0且曲線有明顯的指數(shù)增長期時(shí)，樣本判為陽性；
②可疑:檢測樣本Ct值大于35.0且小于40.0,重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；
③陰性:當(dāng)陰性對照無擴(kuò)增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時(shí)，檢測樣本無Ct值且曲線無明顯的指數(shù)增長期時(shí)，樣本判為陰性。
[0042]下面對本發(fā)明檢測試劑盒及其檢測方法作進(jìn)一步的效果檢測。
[0043]一、靈敏度實(shí)驗(yàn)
將上述陽性質(zhì)控品，依次稀釋為 1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X103、1.0XlO2、1.0 X 11、1.0 X 10°拷貝/μι，進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)。
[0044]雙色熒光定量PCR體系中Η5基因檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)見圖1，雙色熒光定量PCR體系中Ν6基因檢測的敏感性實(shí)見圖2。圖1為雙色熒光PCR體系中Η5基因檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為 I X 18、I X 107、I X 16、I X 105、I X 14、I X 103、I X 12拷貝 /μ? 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。圖2為雙色熒光PCR體系中Ν6基因檢測的敏感性實(shí)驗(yàn)，從左到右依次為I X 108、I X 107、I X 16、I X 105、I X 14、I X 103、I X 12拷貝 /μι 的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果。
[0045]從圖1和圖2中可以看出本試劑盒檢測靈敏度可以達(dá)到100 copies/mL,該雙色突光定量PCR的方法敏感度為普通PCR的200倍，精確性優(yōu)于普通PCR方法。
[0046]二、特異性實(shí)驗(yàn)
根據(jù)上述的雙色熒光定量PCR檢測方法，用禽流感病毒H5N6陽性標(biāo)本(AIV-H7N2)以及其它病毒如豬流感HlNl (SIV-HlNl)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒H5N1亞型(AIV-H5N1 )、禽流感病毒H7N2亞型(AIV-H7N2 )、禽流感病毒H7N9亞型(AIV-H7N9 )、禽流感病毒H9N2(AIV-H9N2)、陰性對照進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)并對產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明方法及試劑盒特異性好，未出現(xiàn)假陽性，吻合度為100%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3和圖4。
[0047]圖3為雙色方法PCR體系中禽流感病毒H5基因的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AIV-H5N1、AIV-H5N6 標(biāo)本為陽性，SIV-H1N1、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2 及不含有病毒的陰性對照品為陰性。
[0048]圖4為雙色方法PCR體系中禽流感病毒N6基因的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，AIV-H5N6為陽性，AIV-H5N1、SIV-HlNl、NDV、AIV-H7N2、AIV-H7N9、AIV-H9N2 及不含有病毒的陰性對照品為陰性。
[0049]三、重復(fù)性試驗(yàn)
將8次獨(dú)立重復(fù)提取含陽性質(zhì)控品的RNA分別進(jìn)行雙色熒光定量PCR擴(kuò)增，均出現(xiàn)一至的曲線，表明本發(fā)明的雙色熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
[0050]為本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒，包括如下成分:病毒RNA核酸提取液、酶混合液、雙色熒光定量PCR Mix、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，其特征在于:所述雙色熒光定量PCR Mix中含有2 X雙色熒光定量PCR buffer, dNTPs、及禽流感病毒H5N6亞型的H5基因和N6基因的特異性引物及探針，序列分別為: H5基因的
上游引物:H5-F:5’ - CACATGCTCAGGACATACTGGA-3’ (SEQ ID N0.1)； 下游引物:H5-R:5，- ACACATTGGGTTTCCGAGGA-3’ (SEQ ID N0.2)；
熒光探針:H5-P:5’ -Fam-AGACACACAACGGGAAGCTCTGCGATC-3’ BHQl (SEQ ID N0.3)； N6基因的
上游引物:N6-F:5’ -TATGTAGAACTAATCAGAGGGAGGCC-3’ (SEQ ID N0.4), 下游引物:N6-R:5，-CCGTCATGCCAGGACCA-3，(SEQ ID N0.5),
熒光探針:N6-P:5’ -CY5-GTAGCACTCTGTGGATCCAAGGAGCGATT-3’ BHQ2 (SEQ ID N0.6)； H5基因的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為Fam，淬滅基團(tuán)為BHQl ;N6基因的熒光探針報(bào)告基團(tuán)為CY5，淬滅基團(tuán)為BHQ2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述2X雙色熒光定量PCR buffer含有pH為7.8的64mM HEPES、8mM MgCl2、10mM KC1、4%DMS0、0.2mM 甜菜堿、0.2mg/mL 海藻糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述病毒RNA提取液中每2L中含有異硫氰酸胍250g，重蒸苯酚500ml，10%十二烷基肌氨酸鈉溶液26.4mL, 0.75M檸檬酸鈉溶液17.6mL, 2M醋酸鈉溶液50mL，余量為雙蒸水，pH值為4.8?5.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述酶混合液中含有Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。
5.一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)提取病毒RNA； 2)雙色熒光定量PCR擴(kuò)增:將雙色熒光定量PCRMix 20μ1中加入酶混合液?μ?，瞬時(shí)離心混勻后，再加入病毒RNA 4μ1 ;放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測的名稱和熒光基團(tuán)種類，設(shè)定循環(huán)條件:42°C 20分鐘；95°C 10分鐘；95°C 10秒，58°C 20秒，采集熒光信號，40個循環(huán)； 3)結(jié)果分析:根據(jù)信噪情況設(shè)定和調(diào)整基線和閾值，通過收集的熒光曲線和CT值判定結(jié)果; ①陽性:當(dāng)陰性對照無擴(kuò)增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時(shí)，檢測樣本的Ct值(35.0且曲線有明顯的指數(shù)增長期時(shí)，樣本判為陽性； ②可疑:檢測樣本Ct值大于35.0且小于40.0,重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性； ③陰性:當(dāng)陰性對照無擴(kuò)增曲線且陽性對照的Ct值<32.0時(shí)，檢測樣本無Ct值且曲線無明顯的指數(shù)增長期時(shí)，樣本判為陰性； 上述所用到的所有試劑均來自權(quán)利要求1~4任一所述的檢測試劑盒。
6.根據(jù)要利要求5所述的一種禽流感H5N6亞型的雙色熒光定量PCR檢測方法，其特征在于:所述雙色熒光定量PCR Mix含有以下成份: 2X雙色熒光定量PCR buffer12.5μ1 H5-F (ΙΟμΜ)?μ? H5-R (ΙΟμΜ)?μ? N6-F (ΙΟμΜ)?μ? N6-R (ΙΟμΜ)?μ? Η5-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1 Ν6-Ρ (ΙΟμΜ)0.6μ1 dNTPs (1mM)?μ?ddH20 (Rnase free)補(bǔ)足 20μ1。
【文檔編號】C12Q1/68GK104498626SQ201410734968
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】張曉瑋, 徐貴峰 申請人:廣州維伯鑫生物科技有限公司