磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浼捌洚a(chǎn)品和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用，屬于納米材料制備技術(shù)和生物催化【技術(shù)領(lǐng)域】。磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒òㄒ韵虏襟E：制備四氧化三鐵納米顆粒；將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)，制備氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒；將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒與氨基酰化酶溶液混合反應(yīng)，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；?；制得的磁性納米顆粒固定化氨基?；赣糜诓鸱植璋彼?。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在確保酶活的前提下，大幅度提高氨基?；傅淖钸m催化溫度和重復(fù)利用效率，并且產(chǎn)物的回收方便，可以重復(fù)利用，適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浼捌洚a(chǎn)品和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料制備技術(shù)和生物催化【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒捌洚a(chǎn)品和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]茶氨酸是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，屬酰胺類小分子化合物，僅被發(fā)現(xiàn)存在于山茶科植物和一種蕈體內(nèi)，是具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。研宄表明，茶氨酸能夠作為一種安全可靠的食品和保健品添加劑用以改善風(fēng)味，降低血壓，幫助緩解焦慮情緒并促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)及抗氧化等作用。
[0003]茶氨酸存在L型和D型兩種對映體，自然界天然存在的茶氨酸多為L型。高效拆分茶氨酸對映體，是深入探討L型和D型茶氨酸對人類健康影響的關(guān)鍵。在眾多的氨基酸拆分技術(shù)中，由于酶法具有拆分效率高、立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、操作簡單和有利于環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，使得它在工業(yè)生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。氨基?；阜ㄊ峭瑫r得到兩種構(gòu)型氨基酸的最佳拆分方法，在日本已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]氨基?；?EC 3.5.1.14 ；aminoacylase)，也稱N-?；?L-氨基酸酰胺水解酶(N-acyl-L-amino-acid aminohydrolase)，它是生物【技術(shù)領(lǐng)域】應(yīng)用最廣泛的十種酶之一。該酶具有較強(qiáng)光學(xué)特異性，它將L-氨基酸酰化物水解成L-氨基酸，而未被水解的D-氨基酸?；锖蚅-氨基酸分離后，經(jīng)過一步水解就可以得到D-氨基酸，從而將L-氨基酸和D-氨基酸分離開來。由于使用游離酶拆分氨基酸時，酶的利用率低，生產(chǎn)成本較高，也不利于產(chǎn)品的分離純化。因此，通過固定化酶拆分氨基酸是工業(yè)應(yīng)用的趨勢。
[0005]納米磁性材料因具有超順磁性、量子尺寸效應(yīng)，表觀磁性等一系列特殊性質(zhì)，近年來成為研宄熱點(diǎn)。根據(jù)不同需要，納米顆粒表面經(jīng)過修飾后可以帶上-NH2、-C00H、-CH0等活性基團(tuán)，這些基團(tuán)又可以再連接抗體、生物酶、蛋白等具有生物活性的大分子物質(zhì)。在生物醫(yī)學(xué)方面，納米磁性材料可用于靶向藥物、核磁共振成像、磁熱療等，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0006]在眾多磁性納米材料中，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒備受關(guān)注，它是反尖晶石結(jié)構(gòu)鐵氧體，具有制備工藝簡單、無毒、性質(zhì)穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)。磁性四氧化三鐵納米顆粒具有良好的表面活性和吸附性能，更具有超順磁性，方便固定化酶在外加磁場的作用下快速回收，避免離心、篩板等耗能步驟。制備Fe3O4磁性納米顆粒的常用方法有共沉淀法、溶膠凝膠法、微乳液法、水熱法(溶劑熱法)、模板合成法。
[0007]中國專利CN 101671664 A公布了一種固定化氨基酰化酶的制備方法，其包含下列步驟:在水中，60-90°C下將固定化材料(卡拉膠和明膠)溶解，降溫至40-60°C，再加入氨基?；福旌暇鶆?，然后將此混合液流加到溫度為20-35?的有機(jī)溶劑中，攪拌，過濾得顆粒，將所得顆粒加入到KCL水溶液中固化，即可制得固定化氨基酰化酶，其中，所述的KCL水溶液中還含有戊二醛。該專利還公開了由其制得的固定化氨基?；讣捌鋺?yīng)用。其制備方法可有效降低固定化材料的凝固點(diǎn)，并且制得的固定化氨基?；甘穷w粒狀，流動性好，可以高效方便的拆分光學(xué)活性氨基酸。上述專利專注于酶的固定化，產(chǎn)品為固體顆粒，且需要過濾回收的固體顆粒，步驟繁瑣。上述專利的產(chǎn)物的最適反應(yīng)溫度為37°C。但是在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)過程中，發(fā)酵罐內(nèi)溫度很難達(dá)到37°C這樣的低溫，或者需要價格高昂的冷卻設(shè)備才能達(dá)到，所以，上述專利的實(shí)用性較差。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒捌洚a(chǎn)品和應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0010]本發(fā)明第一方面提供一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，包括以下步驟:
[0011](I)制備四氧化三鐵納米顆粒；
[0012](2)將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)，制備氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒；
[0013](3)將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒與氨基?；溉芤夯旌戏磻?yīng)，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；浮?br> [0014]步驟(I)中制備四氧化三鐵納米顆粒的方法通過化學(xué)共沉淀法完成，優(yōu)選以下條件能夠制備出磁性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定的磁性四氧化三鐵納米顆粒:
[0015]用六水氯化鐵和七水硫酸亞鐵溶解于去離子水中，使鐵離子和亞鐵離子的摩爾比等于二比一。氮?dú)獬酰厵C(jī)械攪拌邊逐滴加入5mol/L NaOH直至溶液pH為8-11，得到黑色的四氧化三鐵納米顆粒溶液，將此溶液放在55-65°C反應(yīng)0.5-lmin，得到的四氧化三鐵納米顆粒用去離子水和乙醇沖洗，重新分散在50% (v/v)的乙醇中。
[0016]步驟(2)中制備氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒的方法為:
[0017]將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)，30-50°C機(jī)械攪拌18-36h，磁鐵收集氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒，然后用去離子水和無水乙醇洗滌，50-70°C真空干燥，密封保存?zhèn)溆谩?br> [0018]四氧化三鐵納米顆粒與3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為2: 1-4: 1
[0019]步驟(3)中，制備磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶的方法如下:
[0020](I)將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒溶于磷酸緩沖液，使其終濃度為2?Smg/ml，超聲后，加入戊二醛，使戊二醛體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%，25-40°C攪拌8_24h，磁鐵收集，用相同的磷酸緩沖液洗滌納米顆粒除去殘留的戊二醛，得到中間納米顆粒；
[0021](2)將收集的中間納米顆粒與氨基酰化酶溶液混合1-2.5h，磁鐵收集后用相同的磷酸緩沖液洗滌以除去殘留的游離酶，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；?。
[0022]所述的中間納米顆粒與氨基?；傅哪柋葹?: 1-3: 1
[0023]所述的磷酸緩沖液的濃度為0.lmol/L，pH 6.5-7.0。
[0024]本發(fā)明第二方面提供一種由上述制備方法制得的磁性納米顆粒固定化氨基?；?。
[0025]本發(fā)明第三方面提供一種磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶的應(yīng)用，所述的磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸。所述的應(yīng)用包括以下步驟:
[0026]將茶氨酸加入到磷酸緩沖液的體系中42°C保溫5min，然后加入磁性納米顆粒固定化氨基?；?，振蕩反應(yīng)30min，立即沸水浴5min終止反應(yīng)。
[0027]所述的茶氨酸在磷酸緩沖液中的濃度為0.02mol/L，磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶與茶氨酸的比為1.5U: I ymol-3U: I μmol，所述的磷酸緩沖液的濃度為0.lmol/LpH 6.5-7.00
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0029]1、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了利用表面氨基修飾的磁性四氧化三鐵納米顆粒制備固定化氨基?；傅姆椒ǎ瑸榇判约{米粒子固化酶技術(shù)提供了新的應(yīng)用方法。
[0030]2、本發(fā)明利用新方法，在確保酶活的前提下，大幅度提高氨基?；傅淖钸m催化溫度和重復(fù)利用效率。固定化酶的最適反應(yīng)溫度的提高是因?yàn)槊傅臉?gòu)象變化受到限制，酶與底物的結(jié)合需要較高的活化能。高溫會降低底物的傳質(zhì)阻力，因此提高了固定化酶的活性。固定化酶比游離酶具有更高的酶活力，是由于共價鍵提高了固定化酶的穩(wěn)定性，通過共價鍵的作用，固定化酶的構(gòu)型發(fā)生改變使得其對PH變化的穩(wěn)定性得到提高。納米粒子提供的納米微環(huán)境也有一定的緩沖作用，從而提高固定化酶的穩(wěn)定性。
[0031]3、相比于現(xiàn)有技術(shù)需要37°C的條件，本發(fā)明中的固定化方法可以將氨基?；傅淖钸m反應(yīng)溫度大幅度提升至52°C，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。同時本發(fā)明中使用的磁性四氧化三鐵顆粒具有磁性，在磁鐵或磁場作用下可以輕松富集，相比于現(xiàn)有技術(shù)需要過濾回收固體顆粒，回收更容易，回收效率更高。因此本發(fā)明的工藝簡單，整個制備系統(tǒng)容易構(gòu)建，操作簡便，條件易控，成本低廉，產(chǎn)物的回收方便，可以重復(fù)利用，適合于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
[0032]4、使用納米顆粒作為載體，磁性四氧化三鐵納米顆粒比表面積大，能夠結(jié)合更多的酶，提高固定化酶的結(jié)合率；其特點(diǎn)為磁性納米顆粒外周結(jié)合酶分子，相比其他固定化酶的方法，酶的空間位阻更小，反應(yīng)過程更接近游離酶，更易結(jié)合反應(yīng)底物，固定化酶催化效率更高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為表面氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒的掃描電鏡圖；
[0034]圖2為溫度對固定化酶與游離酶活性的影響；
[0035]圖3為pH對固定化酶與游離酶活性的影響；
[0036]圖4為固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性曲線
[0037]圖5為固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0039]實(shí)施例1
[0040]表面氨基修飾的磁性四氧化三鐵納米顆粒制備
[0041](I)稱取6.76g六水氯化鐵和3.48g七水硫酸亞鐵溶解于10ml去離子水中，使鐵離子和亞鐵離子的摩爾比等于二比一。氮?dú)獬?，邊機(jī)械攪拌邊逐滴加入5mol/L NaOH直至溶液pH = 10，得到黑色的四氧化三鐵納米顆粒溶液，將此溶液放在60°C反應(yīng)30min，得到的四氧化三鐵納米顆粒用去離子水和乙醇沖洗3次，重新分散在50% (v/v)的乙醇中。
[0042](2)將1.5g磁性四氧化三鐵納米顆粒超聲分散到150ml 50% (v/v)的乙醇中，加Λ 500 μ I 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，40°C機(jī)械攪拌24h，磁鐵收集氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒，然后用去離子水和無水乙醇洗滌三次，60°C真空干燥，密封保存?zhèn)溆肙
[0043]本實(shí)施例制得的表面氨基修飾的磁性四氧化三鐵納米顆粒掃描電鏡圖如圖1所示，接枝后的四氧化三鐵納米顆粒粒徑略大，為40nm左右，顆粒分布也更加均勻。
[0044]實(shí)施例2
[0045]將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒與氨基?；溉芤夯旌戏磻?yīng)，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；浮?br> [0046](I)將一定量經(jīng)過氨基修飾的磁性四氧化三鐵納米顆粒溶于0.lmol/L,pH 7.0磷酸緩沖液，使其終濃度為8mg/ml，超聲15min，加入一定量戊二醛，使其終濃度達(dá)到1.0%，30°C攪拌lh，磁鐵收集，用0.lmol/L, pH 7.0磷酸緩沖液洗滌納米顆粒以除去殘留的戊二醛。
[0047](2)將收集的納米顆粒與一定濃度的氨基?；溉芤夯旌?.5h，磁鐵收集后用0.lmol/L, pH 7.0磷酸緩沖液洗滌以除去殘留的游離酶。
[0048]實(shí)施例3
[0049]實(shí)施例2制得的磁性納米顆粒固定化氨基?；概c游離酶的酶活性與酶反應(yīng)溫度的確定。
[0050]量取40mL 0.lmol/LpH7.0的磷酸緩沖液于250mL錐形瓶，加入5mL去離子水和5mL 0.2mo 1/L N-乙酰-DL-茶氨酸，分別在 29 °C、42 °C、52 °C、62 °C、72 °C 保溫 5min，加入20mg游離氨基?；富?qū)嵤├?制得的磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶，振蕩反應(yīng)30min，立即沸水浴5min終止反應(yīng)，冷卻后稀釋至一定濃度，取ImL待測樣品進(jìn)行茚三酮反應(yīng)，充分搖勻，測定其0D570，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到L-茶氨酸的產(chǎn)量。酶活力單位定義為:在pH7.0，42°C下，Ih內(nèi)酶催化反應(yīng)生產(chǎn)I μ mol L-茶氨酸為一個活力單位(U)。以最大酶活為100%，計(jì)算相對酶活。
[0051]其中溫度對磁性納米顆粒固定化氨基?；富蛴坞x酶活性的影響如圖2所示，由圖2可知，游離酶的最適溫度為42°C，而固定化酶的最適反應(yīng)溫度提高到52°C，大幅度提高了最適酶活。
[0052]實(shí)施例4
[0053]實(shí)施例2制得的磁性納米顆粒固定化氨基?；概c游離酶的酶活性與酶反應(yīng)pH的確定。
[0054]量取40mL 0.lmol/L, pH 分別為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的磷酸緩沖液于 250mL 錐形瓶，加入5mL去離子水和5mL 0.2mol/L N-乙酰-DL-茶氨酸，在42°C保溫5min，加入20mg游離氨基?；富?qū)嵤├?制得的磁性納米顆粒固定化氨基?；福袷幏磻?yīng)30min，立即沸水浴5min終止反應(yīng)，冷卻后稀釋至一定濃度，取ImL待測樣品進(jìn)行茚三酮反應(yīng)，充分搖勻，測定其0D570，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到L-茶氨酸的產(chǎn)量。酶活力單位定義為:在pH7.0，42°C下，Ih內(nèi)酶催化反應(yīng)生產(chǎn)I μ mol L-茶氨酸為一個活力單位(U)。以最大酶活為100%，計(jì)算相對酶活，確定酶反應(yīng)的最適pH。
[0055]其中pH對磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶或游離酶活性的影響如圖3所示，由圖3可知，當(dāng)緩沖溶液pH低于7.0時，酶活隨pH升高而增大，pH超過7.0后，酶活迅速下降。
[0056]實(shí)施例5
[0057]將等量游離酶和實(shí)施例2中得到的固定化酶分別置于29°C、42°C、52°C、62°C、72°C保溫lh，取出后和底物在最適溫度下反應(yīng)，以初始酶活為對照，測定相對剩余酶活。
[0058]其中游離酶與固定化酶的熱穩(wěn)定性曲線如圖4所示，當(dāng)溫度低于50°C時，固定化酶酶活基本不損失，游離酶酶活損失也不大。隨著溫度的升高，酶活力迅速減少，在72°C保溫Ih后，游離酶僅剩14 %的酶活力，而固定化酶還剩下39 %的酶活，說明酶經(jīng)過固定化后，熱穩(wěn)定性能得到提高，這在實(shí)際工業(yè)化拆分中具有重要意義。
[0059]實(shí)施例6
[0060]最適溫度下(52°C )進(jìn)行實(shí)施例3的酶活實(shí)驗(yàn)，回收每次催化反應(yīng)后的固定化酶，用0.lmol/L, pH 7.0磷酸緩沖液清洗后重新加入新鮮配制的反應(yīng)溶液中，測定其活性，連續(xù)測定6次，考察固定化酶的剩余活性隨著使用次數(shù)的變化情況。
[0061]固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性曲線如圖5所示，重復(fù)使用3次后，磁性四氧化三鐵納米顆粒固定的氨基?；妇哂?6%的活性，而使用6次后，固定化酶仍具有40%的活力。
[0062]實(shí)施例7
[0063]一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，包括以下步驟:
[0064](I)通過化學(xué)共沉淀法制備四氧化三鐵納米顆粒:
[0065]用六水氯化鐵和七水硫酸亞鐵溶解于去離子水中，使鐵離子和亞鐵離子的摩爾比等于二比一。氮?dú)獬?，邊機(jī)械攪拌邊逐滴加入5mol/LNaOH直至溶液pH為8，得到黑色的四氧化三鐵納米顆粒溶液，將此溶液放在55°C反應(yīng)lmin，得到的四氧化三鐵納米顆粒用去離子水和乙醇沖洗，重新分散在50% (v/v)的乙醇中，制備出磁性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定的磁性四氧化三鐵納米顆粒；
[0066](2)將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，四氧化三鐵納米顆粒與3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為2: 1，氮?dú)獗Ｗo(hù)，30°C機(jī)械攪拌36h，磁鐵收集氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒，然后用去離子水和無水乙醇洗滌，50°C真空干燥，密封保存?zhèn)溆茫?br> [0067](3)將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒溶于磷酸緩沖液，使其終濃度為2mg/ml，超聲后，加入戊二醛，使戊二醛體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0 %，25 °C攪拌24h，磁鐵收集，用相同的磷酸緩沖液洗滌納米顆粒除去殘留的戊二醛，得到中間納米顆粒；
[0068]將收集的中間納米顆粒與氨基?；溉芤夯旌蟣h，中間納米顆粒與氨基?；傅哪柋葹?: I。磁鐵收集后用相同的磷酸緩沖液洗滌以除去殘留的游離酶，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；?br> [0069]磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸，包括以下步驟:
[0070]將茶氨酸加入到磷酸緩沖液的體系中42°C保溫5min，然后加入磁性納米顆粒固定化氨基?；?，振蕩反應(yīng)30min，立即沸水浴5min終止反應(yīng)。
[0071]茶氨酸在濃度為0.lmol/L pH 6.5的磷酸緩沖液中的濃度為0.02mol/L，磁性納米顆粒固定化氨基?；概c茶氨酸的比為1.5U: I μ mol ο
[0072]實(shí)施例8
[0073]一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，包括以下步驟:
[0074](I)通過化學(xué)共沉淀法制備四氧化三鐵納米顆粒:
[0075]用六水氯化鐵和七水硫酸亞鐵溶解于去離子水中，使鐵離子和亞鐵離子的摩爾比等于二比一。氮?dú)獬?，邊機(jī)械攪拌邊逐滴加入5mol/L NaOH直至溶液pH為11，得到黑色的四氧化三鐵納米顆粒溶液，將此溶液放在65°C反應(yīng)0.5min，得到的四氧化三鐵納米顆粒用去離子水和乙醇沖洗，重新分散在50% (v/v)的乙醇中，制備出磁性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定的磁性四氧化三鐵納米顆粒；
[0076](2)將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，四氧化三鐵納米顆粒與3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為4: 1，氮?dú)獗Ｗo(hù)，50°C機(jī)械攪拌18h，磁鐵收集氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒，然后用去離子水和無水乙醇洗滌，70°C真空干燥，密封保存?zhèn)溆茫?br> [0077](3)將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒溶于磷酸緩沖液，使其終濃度為8mg/ml，超聲后，加入戊二醛，使戊二醛體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%，40°C攪拌8h，磁鐵收集，用相同的磷酸緩沖液洗滌納米顆粒除去殘留的戊二醛，得到中間納米顆粒；
[0078]將收集的中間納米顆粒與氨基酰化酶溶液混合2.5h，中間納米顆粒與氨基酰化酶的摩爾比為3: I。磁鐵收集后用相同的磷酸緩沖液洗滌以除去殘留的游離酶，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；?br> [0079]磁性納米顆粒固定化氨基?；赣糜诓鸱植璋彼?，包括以下步驟:
[0080]將茶氨酸加入到磷酸緩沖液的體系中42°C保溫5min，然后加入磁性納米顆粒固定化氨基?；?，振蕩反應(yīng)30min，立即沸水浴5min終止反應(yīng)。
[0081]茶氨酸在濃度為0.lmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液中的濃度為0.02mol/L，磁性納米顆粒固定化氨基?；概c茶氨酸的比為3U: I μ mol ο
[0082]上述的對實(shí)施例的描述是為便于該【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備四氧化三鐵納米顆粒； (2)將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散后，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，與3-氨丙基三乙氧基硅烷反應(yīng)，制備氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒； (3)將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒與氨基酰化酶溶液混合反應(yīng)，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；浮?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，步驟(2)中制備氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒的方法為: 將四氧化三鐵納米顆粒超聲分散到乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)，30-50°C機(jī)械攪拌18-36h，磁鐵收集氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒，然后用去離子水和無水乙醇洗滌，50-70°C真空干燥，密封保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?，四氧化三鐵納米顆粒與3-氨丙基三乙氧基硅烷的摩爾比為2: 1-4: 1
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，步驟(3)中，制備磁性納米顆粒固定化氨基?；傅姆椒ㄈ缦? (1)將氨基修飾的四氧化三鐵納米顆粒溶于磷酸緩沖液，使其終濃度為2?8mg/ml，超聲后，加入戊二醛，使戊二醛體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%，25-40?攪拌8-24h，磁鐵收集，用相同的磷酸緩沖液洗滌納米顆粒除去殘留的戊二醛，得到中間納米顆粒； (2)將收集的中間納米顆粒與氨基?；溉芤夯旌?-2.5h，磁鐵收集后用相同的磷酸緩沖液洗滌以除去殘留的游離酶，得到磁性納米顆粒固定化氨基?；?。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，所述的中間納米顆粒與氨基酰化酶的摩爾比為2: 1-3: 1
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅闹苽浞椒?，其特征在于，所述的磷酸緩沖液的濃度為0.lmol/L，pH為6.5-7.0。
7.一種由權(quán)利要求1所述的制備方法制得的磁性納米顆粒固定化氨基?；?。
8.一種如權(quán)利要求7所述的磁性納米顆粒固定化氨基?；傅膽?yīng)用，其特征在于，所述的磁性納米顆粒固定化氨基酰化酶用于拆分茶氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅膽?yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括以下步驟: 將茶氨酸加入到磷酸緩沖液的體系中42°C保溫5min，然后加入磁性納米顆粒固定化氨基?；?，振蕩反應(yīng)30min，立即沸水浴5min終止反應(yīng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種磁性納米顆粒固定化氨基?；傅膽?yīng)用，其特征在于，所述的茶氨酸在磷酸緩沖液中的濃度為0.02mol/L，磁性納米顆粒固定化氨基?；概c茶氨酸的比為1.5U: I ymol-3U: I μ mol，所述的磷酸緩沖液的濃度為0.lmol/L，pH為6.5~7.00
【文檔編號】C12P41/00GK104480101SQ201410736026
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】李平, 馮駿晨, 莫婷 申請人:同濟(jì)大學(xué)