一種檢測α-L-巖藻糖苷酶含量的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種α-L-巖藻糖苷酶檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑R1和試劑R2組成；其中試劑R1的組分包括：生物緩沖液1、金屬離子絡(luò)合物、α-L-巖藻糖苷酶反應(yīng)底物、表面活性劑1、防腐劑1；試劑R2的組分包括：生物緩沖液2、2-氯-對硝基苯酚-a-L-巖藻糖苷酶、激活劑、表面活性劑2、防腐劑2。本發(fā)明中的試劑盒采用雙試劑模式，檢測靈敏度高、檢測限低、線性測試范圍寬、精確度高、重復性好、穩(wěn)定性好、抗干擾性強?？梢杂糜诎胱詣?、全自動生化分析儀，所需檢測儀器（生化分析儀）在各大醫(yī)院和檢驗中心普遍使用。適用于臨床上的推廣應(yīng)用，特別對于急診能實現(xiàn)快速診斷。
【專利說明】一種檢測a-L-巖藻糖苷酶含量的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種a -L-巖藻糖苷酶檢測試劑盒及其制 備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] AFU是一種酸性水解酶，廣泛分布于哺乳動物體液和組織細胞的溶酶體中，以肝腎 等組織活性較高。其主要生理功能是參與含巖藻糖基的各種糖脂、糖蛋白、黏多糖等大分子 物質(zhì)的分解代謝。它合成于細胞中，正常情況下其體內(nèi)含量始終保持在一個低水平范圍內(nèi)。 AFU的化學本質(zhì)是一種糖蛋白，它在體內(nèi)分布相對分子質(zhì)量也不盡相同，其血中的相對分子 質(zhì)量為2. 7 X 105?3. 9 X IOOTa，遠大于白細胞和肝臟細胞中的。AFU在人體中呈多型性， 當pH值為3. 8?3. 9時酶活性基本消失，而在pH值為6. 2?7. 0時酶活性上升。早期測 定該酶主要用于診斷遺傳性AFU缺乏癥，并以此與其他遺傳性黏多糖儲積病進行鑒別。自 Deugnier提出AFU對原發(fā)性肝癌有一定提示作用后，這方面的研究也相應(yīng)增多。
[0003] AFU常表達于PHC患者發(fā)病早期，其生物活性明顯高于繼發(fā)性肝癌及肝硬化，它與 AFP濃度無明顯相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)血清的AFU在肝癌患者中的活性明顯高于在慢性肝炎、 肝硬化、其他腫瘤患者及健康人群中的活性，較AFU具有更高的敏感性，若兩者聯(lián)合檢測可 將肝癌的敏感性提高到82. 16%。有研究表明在診斷肝癌時AFU活性與腫瘤大小無關(guān)，這 就對于AFP陰性和小肝癌患者的診斷更具有意義。而且，有研究認為，AFU水平與肝癌患者 TW分期呈相關(guān)性，AFU水平越高，?!分期越晚，遂認為AFU是一個有效的用于判斷原發(fā)性 肝癌病情的血清學指標。
[0004] PHC患者在有效治療后，AFU水平發(fā)生顯著下降，這為AFU陰性的原發(fā)性肝癌患者 診療提供重要的參考標準。若術(shù)后或藥物治療后，患者血清AFU再度升高，說明病情惡化。 有研究認為PHC患者癌細胞合成和釋放AFU增加，或肝癌時血清AFU激活物增加及AFU作 用的底物濃度增加，最終導致血清AFU增高。腫瘤切除后癌細胞減少，上述機制發(fā)生改變， 使酶活性下降，所以含量降低；當腫瘤復發(fā)時血清AFU可再次升高。因此AFU為PHC患者治 療后的動態(tài)監(jiān)測、療效和預(yù)后判斷以及轉(zhuǎn)歸提供非常重要的信息。
[0005] AFU除在PHC相應(yīng)升高外，在一些非肝癌性疾病如肝硬化、急慢性肝炎、病毒性肝 炎、腎病、糖尿病、胰腺炎、甲狀腺功能減低及白血病患者中，其血清水平也會升高。所以AFU 在診斷上述疾病時具有很高的診斷價值。同時，有研究報道AFU在惡性胸腔積液中含量高 于良性，所以AFU是判斷良、惡性胸腔積液的可靠依據(jù)；其機制為人體感染乙型肝炎病毒 (HBV)后，HBV活躍復制啟動肝臟組織炎癥反應(yīng)因素，使肝細胞出現(xiàn)變性、壞死，進而肝細胞 再生和纖維組織增生，從而導致AFU活性升高。
[0006] 目前，臨床上對AFU的測定方法很多，有熒光猝滅法、速率法、終點法等。目前在臨 床上應(yīng)用較為廣泛的是酶法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測時間短，穩(wěn)定性 好、重復性好、精確度高、檢測靈敏度高、線性測試范圍寬、抗干擾性強的a-L-巖藻糖苷酶 檢測試劑盒，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明的第一方面提供一種a -L-巖藻糖苷酶 檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑Rl和試劑R2組成；其中試劑Rl的組分包括：生物緩沖液 1、金屬離子絡(luò)合物、a-L-巖藻糖苷酶反應(yīng)底物、表面活性劑1、防腐劑1 ;試劑R2的組分包 括：生物緩沖液2、2_氯-對硝基苯酚-a-L-巖藻糖苷酶、激活劑、表面活性劑2、防腐劑2。
[0009] 優(yōu)選的，所述試劑Rl中，所述生物緩沖液1選自磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、甘氨 酸緩沖液、硼酸緩沖液或檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合；更優(yōu)選Tris緩沖 液，其原因是Tris緩沖液堿性較強，可調(diào)節(jié)PH范圍廣，對生物化學過程干擾很小，不與鈣、 鎂離子及重金屬離子發(fā)生沉淀。所述試劑R2中，所述生物緩沖液2選自磷酸鹽緩沖液、Tris 緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液或檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合。
[0010] 優(yōu)選的，所述Rl試劑中，生物緩沖液1的濃度為20?200mmol/L，PH7. 0-7. 5 ;R2 試劑中，生物緩沖液2的濃度為20?200mmol/L，PH7. 0-7. 5。 toon] 優(yōu)選的，為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果，本發(fā)明對所述試劑Rl中 的生物緩沖液1進行了改進，所述試劑Rl中的生物緩沖液1包括下列組分：水蘇糖、明礬、 果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉和甘氨酸，且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉、甘氨酸 的總濃度為3. 5 - 7. 5g/L，生物緩沖液1的pH值為7. 2 - 7. 6。
[0012] 優(yōu)選的，各組分在生物緩沖液1中的濃度為：
[0013]

【權(quán)利要求】
1. 一種a -L-巖藻糖苷酶檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑R1和試劑R2組成；其中試 劑R1的組分包括：生物緩沖液1、金屬離子絡(luò)合物、a -L-巖藻糖苷酶反應(yīng)底物、表面活性劑 1、防腐劑1 ;試劑R2的組分包括：生物緩沖液2、2_氯-對硝基苯酚-a-L-巖藻糖苷酶、激 活劑、表面活性劑2、防腐劑2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中，所述生物緩沖液1選自 磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液或檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種 或多種的組合；所述試劑R2中，所述生物緩沖液2選自磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸 緩沖液、硼酸緩沖液或檸檬酸-磷酸鹽緩沖液中的一種或多種的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述R1試劑中，生物緩沖液1的濃 度為20?200mmol/L，PH7. 0-7. 5 ;R2試劑中，生物緩沖液2的濃度為20?200mmol/L， PH7. 0-7. 5。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述R1試劑中，金屬離子絡(luò)合物選自 乙二胺四乙酸二鈉、氨基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸中的一種或多種的組合，濃度為1? 5mmol/L〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述R1試劑中，a-L-巖藻糖苷酶反應(yīng) 底物為2-氯-對硝基苯酚-a-L-巖藻糖苷，濃度為2?20mmol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述R1試劑中，所述表面活性劑1為椰 子油脂肪酸二乙醇酰胺，濃度為5?55mmol/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述防腐劑1選自疊氮鈉、硫柳汞、 ProClin300中的一種；所述R2試劑中，所述防腐劑2選自疊氮鈉、硫柳汞、ProClin300中的 一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述R2試劑中，所述煙酰胺腺嘌呤二 核苷酸還原態(tài)的濃度為0. 5?2mmol/L ;所述R2試劑中，所述激活劑為磷脂酰膽堿，濃度為 2 ?20mmol/L。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑R1中的生物緩沖液1包括 下列組分：水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉和甘氨酸，且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸 鈉、六偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度為3. 5 - 7. 5g/L，生物緩沖液1的pH值為7. 2 - 7. 6。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9任一權(quán)利要求所述的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征在 于，具體包括如下步驟： (1) 按照比例分別配置試劑R1、試劑R2,按照需要的a-L-巖藻糖苷酶參考校準品濃度 將相應(yīng)的a-L-巖藻糖苷酶標準品分別加入校準品中，制備得到含有不同濃度a-L-巖藻 糖苷酶標準品的一組校準品，并繪制標準曲線； (2) 將待測樣本與試劑R1和R2按一定比例混合，使其充分反應(yīng)； (3) 用全自動生化分析儀測定單位時間內(nèi)吸光度變化率A A/min ; (4) 根據(jù)吸光度變化率計算出樣本中a-L-巖藻糖苷酶的活性。
【文檔編號】C12Q1/34GK104388532SQ201410736267
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】吉權(quán) 申請人:重慶乾德生物技術(shù)有限公司