一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中包括如下組分，氨基酸為1400-1500mg，維生素為70-75mg，鹽類為9800-10000mg，有機質(zhì)為9500-9700mg，蛋白質(zhì)為76-80mg。本發(fā)明配制的培養(yǎng)基很好地滿足了免疫細(xì)胞生長所需的特定條件，更加適合免疫細(xì)胞的生長，明顯提高了細(xì)胞增殖效率及生物學(xué)效力。所述培養(yǎng)基克服了現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)基中添加的人或動物血清及組分受限供體的相異性導(dǎo)致質(zhì)量每批間存在差異的缺陷，質(zhì)量易于控制，且不會因血清質(zhì)量問題遭到污染，殺瘤率效果好，成本低。
【專利說明】一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及體外培養(yǎng)免疫細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的過繼性細(xì)胞免疫治療(Adoptivecellular immunotherapy,ACI 或AIT)是指向腫瘤患者轉(zhuǎn)輸具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞(特異性的和相對特異性的)直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體免疫反應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。該細(xì)胞免疫治療是腫瘤康復(fù)醫(yī)學(xué)一種新興的、具有顯著療效的全新的抗腫瘤治療方法，被稱為二十一世紀(jì)腫瘤綜合治療模式中最活躍、最有發(fā)展前途的一種治療手段。
[0003]有效地細(xì)胞免疫治療就離不開在體外大量培養(yǎng)、擴(kuò)增和活化免疫細(xì)胞。適宜免疫細(xì)胞生長的培養(yǎng)基為細(xì)胞提供了適宜的基礎(chǔ)環(huán)境如營養(yǎng)物質(zhì)、滲透壓、PH值等，并且細(xì)胞將代謝的產(chǎn)物排放至培養(yǎng)基中。市面現(xiàn)有培養(yǎng)基并非針對免疫細(xì)胞培養(yǎng)所需條件進(jìn)行配制，導(dǎo)致細(xì)胞增殖效率及生物學(xué)效力不佳，而且很多培養(yǎng)基添加了人或動物血清及組分來補充完全。但人血清昂貴，不適宜大規(guī)模擴(kuò)增，且由于供體的相異性，導(dǎo)致血清質(zhì)量每批間存在差異，尤其是被肝炎病毒或HIV污染的危險。添加有人血白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人胰島素等人源性組分的無血清培養(yǎng)基，雖經(jīng)過病源檢測及消毒，但仍避免不了由于供體的不同每批間存在差異，不利于質(zhì)量的控制。動物血清如胎牛血清、新生牛血清等來自牛材料的血清組分，雖然有足夠的量供應(yīng)，價格便宜，但存在傳播傳染病的風(fēng)險，如支原體、病毒(如BSE病源因子)污染的危險。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基特別針對免疫細(xì)胞的培養(yǎng)，滿足免疫細(xì)胞生長所需的特定條件，更加適合免疫細(xì)胞的生長，提高細(xì)胞增殖效率及生物學(xué)效力，且不會因血清質(zhì)量問題遭到污染，質(zhì)量可控性強，成本低。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是提供上述無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中包括如下組分，
[0008]氨基酸為1400-1500mg，維生素為70_75mg，鹽類為9800-10000mg，有機質(zhì)為9500-9700mg,蛋白質(zhì)為76_80mg。優(yōu)選的,所述氨基酸為1453mg,維生素為72.31mg,鹽類為9841.1524mg,有機質(zhì)為 9610.64mg,蛋白質(zhì)為 78.5mg。
[0009]所述氨基酸為甘氨酸、L-精氨酸、L-門冬酰胺、L-天冬氨酸、L-鹽酸胱氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-羥脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物、L-纈氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸二肽的組合物。
[0010]所述氨基酸中的各組分的濃度為甘氨酸17-19mg/L、L-精氨酸185_195mg/L、L-門冬酰胺40-45mg/L、L-天冬氨酸15_20mg/L、L-鹽酸胱氨酸55_60mg/L、L-谷氨酸10_15mg/L、L-組氨酸20-30mg/L、L-羥脯氨酸10_15mg/L、L-異亮氨酸120_130mg/L、L-亮氨酸75-85mg/L、L-鹽酸賴氨酸 95_105mg/L、L-蛋氨酸 20_25mg/L、L-苯丙氨酸 30_35mg/L、L-脯氨酸 20-30mg/L、L-絲氨酸 40_50mg/L、L-蘇氨酸 25_35mg/L、L-色氨酸 10_20mg/L、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物40-45mg/L、L-纈氨酸40_45mg/L、谷氨酰胺和丙氨酸二肽480_520mg/L0優(yōu)選的，所述氨基酸中的各組分的濃度為甘氨酸18mg/L、L-精氨酸190mg/L、L-門冬酰胺45mg/L、L-天冬氨酸20mg/L、L-鹽酸胱氨酸60mg/L、L_谷氨酸15mg/L、L_組氨酸25mg/L、L-輕脯氨酸15mg/L、L-異亮氨酸130mg/L、L-亮氨酸80mg/L、L-鹽酸賴氨酸100mg/L、L-蛋氨酸25mg/L、L-苯丙氨酸35mg/L、L-脯氨酸25mg/L、L-絲氨酸45mg/L、L-蘇氨酸30mg/L、L-色氨酸15mg/L、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物40mg/L、L-纈氨酸40mg/L、谷氨酰胺和丙氨酸二肽500mg/L。
[0011]所述維生素為維生素H、氯化膽堿、泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、維生素B12和肌醇的組合物；所述維生素中的各組分的濃度分別為維生素 H 0.2-0.4mg/L、氯化膽堿 0.8-1.2mg/L、泛酸鈣 2.5-3.5mg/L、葉酸 4_6mg/L、煙酰胺8-12mg/L、對氨基苯甲酸0.4-0.6mg/L、鹽酸批P多醇1.1-1.3mg/L、鹽酸硫胺素1.1-1.3mg/L、維生素B120.0lmg/L、肌醇48_52mg/L。優(yōu)選的，所述維生素中的各組分的濃度分別為維生素H0.4mg/L、氯化膽堿lmg/L、泛酸|丐3mg/L、葉酸5mg/L、煙酰胺10mg/L、對氨基苯甲酸0.5mg/L、鹽酸批P多醇1.2mg/L、鹽酸硫胺素1.2mg/L、維生素B120.0lmg/L、肌醇50mg/L。
[0012]所述有機質(zhì)為葡萄糖、谷胱甘肽、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、酚紅、丙酮酸鈉、次黃嘌呤、亞油酸、鹽酸丁二胺、硫辛酸、胸苷和吐溫80的組合物；所述有機質(zhì)中的各組分的濃度為葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽l_4mg/L、輕乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酹紅5_7mg/L、丙酮酸鈉100mg/L、次黃嘌呤l_3mg/L、亞油酸0.04mg/L、鹽酸丁二胺0.1-0.2mg/L、硫辛酸0.l-ο.2mg/L、胸苷0.4-0.6mg/L、吐溫80為0_2mg/L。優(yōu)選的，所述有機質(zhì)中的各組分的濃度為葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽2mg/L、輕乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酹紅6mg/L、丙酮酸鈉100mg/L、次黃嘌呤2mg/L、亞油酸0.04mg/L、鹽酸丁二胺0.lmg/L、硫辛酸0.lmg/L、胸苷0.4mg/L、吐溫80為0-2mg/L。為增加有機質(zhì)的溶解度，可加入助溶劑吐溫80。
[0013]所述蛋白質(zhì)為重組人血白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、重組人胰島素、重組人生長激素的組合物。所述蛋白質(zhì)中的組合物濃度為重組人血白蛋白2-4mg/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白50-70mg/L、重組人胰島素12-16mg/L重組人生長激素0.3-0.6mg/L。優(yōu)選的,所述蛋白質(zhì)中的組合物濃度為重組人血白蛋白3mg/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白60mg/L、重組人胰島素15mg/L重組人生長激素0.5mg/Lo
[0014]所述鹽類為硝酸鈣四水合物、硫酸鎂、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、亞硒酸鈉五水合物、硫酸銅五水合物、硫酸亞鐵七水合物、氯化鎳、氯化亞錫二水合物、硫酸鋅七水合物的組合物。所述硫酸鎂和磷酸氫二鈉均為無結(jié)晶水。
[0015]所述鹽類中的各組分的濃度為硝酸鈣四水合物70-85mg/L、硫酸鎂58_62mg/L、氯化鉀 450-500mg/L、碳酸氫鈉 2450_2550mg/L、氯化鈉 6000mg/L、磷酸氫二鈉 700mg/L、亞硒酸鈉五水合物0.13-0.16mg/L、硫酸銅五水合物0.002-0.003mg/L、硫酸亞鐵七水合物0.3-0.6mg/L、氯化鎳 0.0001-0.0002mg/L、氯化亞錫二水合物 0.0001-0.0002mg/L、硫酸鋅七水合物0.3-0.5mg/L。優(yōu)選的，鹽類中的各組分的濃度為硝酸鈣四水合物80mg/L、硫酸鎂60mg/L、氯化鉀500mg/L、碳酸氫鈉2500mg/L、氯化鈉6000mg/L、磷酸氫二鈉700mg/L、亞硒酸鈉五水合物0.15mg/L、硫酸銅五水合物0.002mg/L、硫酸亞鐵七水合物0.5mg/L、氯化鎳0.0002mg/L、氯化亞錫二水合物0.0002mg/L、硫酸鋅七水合物0.5mg/L。
[0016]所述培養(yǎng)基的PH值為6.8-7.2，優(yōu)選的培養(yǎng)基的PH值為7.0。可以用0.lmol/L鹽酸和0.lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值。所述培養(yǎng)基通過0.22um濾膜過濾兩次除菌。
[0017]所述培養(yǎng)基的保藏溫度為3_5°C，優(yōu)選的為4°C。所述培養(yǎng)基需要避光保藏。
[0018]上述無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的使用方法，其步驟包括:將需要培養(yǎng)的免疫細(xì)胞用生理鹽水離心，去除上清液；計數(shù)細(xì)胞，用無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞配制成濃度為I X 16個/mL的細(xì)胞懸液；按每孔2mL培養(yǎng)基細(xì)胞懸液加入6孔板中，加入1000IU/mL的INFt干擾素，37°C培養(yǎng)24小時；加入50ng/mL CD3單抗和500IU/mL的IL-2 ;每隔48小時補加無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和500IU/mL的IL-2，計數(shù)至I X 16個/mL細(xì)胞濃度，共培養(yǎng)14天，觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0019]本發(fā)明制備的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基尤為適合淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于:
[0021](I)本發(fā)明配制的培養(yǎng)基是特別針對免疫細(xì)胞培養(yǎng)的，滿足免疫細(xì)胞生長所需的特定條件，更加適合免疫細(xì)胞的生長，明顯提高了細(xì)胞增殖效率及生物學(xué)效力。
[0022](2)本發(fā)明配制的培養(yǎng)基克服了現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)基中添加的人或動物血清及組分受限供體的相異性導(dǎo)致質(zhì)量每批間存在差異的缺陷，而且不會因血清質(zhì)量問題遭到污染。
[0023](3)本發(fā)明配制的培養(yǎng)基的質(zhì)量可控，殺瘤率效果好，成本低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1為四組樣品的細(xì)胞增值率對比圖。
[0025]圖2為四組樣品的細(xì)胞存活率對比圖。
[0026]圖3為四組樣品的細(xì)胞的表型比較圖。
[0027]圖4為四組樣品的細(xì)胞的殺瘤率比較圖。

【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0029]實施例1
[0030]將三蒸水作為溶劑，并溶解有氨基酸、維生素、鹽類、有機質(zhì)和蛋白質(zhì)，配制成培養(yǎng)基，為增加有機質(zhì)的溶解度可加入助溶劑吐溫80，用0.lmol/L鹽酸和0.lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值，使培養(yǎng)基的PH值為6.8-7.2。培養(yǎng)基經(jīng)0.22um濾膜過濾兩次除菌，4攝氏度冰箱避光保存即可。
[0031]以IL配制好的培養(yǎng)基為準(zhǔn)，其組分中含有以下濃度的組分:
[0032]氨基酸成分:甘氨酸濃度為18mg/L、L-精氨酸濃度為190mg/L、L_門冬酰胺45mg/L、L-天冬氨酸20mg/L、L-鹽酸胱氨酸60mg/L、L-谷氨酸15mg/L、L-組氨酸25mg/L、L-輕脯氨酸15mg/L、L-異亮氨酸130mg/L、L-亮氨酸80mg/L、L-鹽酸賴氨酸100mg/L、L-蛋氨酸 25mg/L、L-苯丙氨酸 35mg/L、L-脯氨酸 25mg/L、L-絲氨酸 45mg/L、L-蘇氨酸 30mg/L、L-色氨酸15mg/L、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物40mg/L、L_纈氨酸40mg/L、谷氨酰胺&丙氨酸二妝 500mg/L,共計 1453mg/L。
[0033]維生素成分:維生素H 0.4mg/L、氯化膽堿lmg/L、泛酸I丐3mg/L、葉酸5mg/L、煙酰胺10mg/L、對氨基苯甲酸0.5mg/L、鹽酸批卩多醇1.2mg/L、鹽酸硫胺素1.2mg/L、維生素B120.0lmg/L、肌醇 50mg/L，共計 72.3lmg/L
[0034]鹽類成分:硝酸I丐四水合物80mg/L、硫酸鎂無水60mg/L、氯化鉀500mg/L、碳酸氫鈉2500mg/L、氯化鈉6000mg/L、磷酸氫二鈉無水700mg/L、亞硒酸鈉五水合物0.15mg/L、硫酸銅五水合物0.002mg/L、硫酸亞鐵七水合物0.5mg/L、氯化鎳0.0002mg/L、氯化亞錫二水合物0.0002mg/L、硫酸鋅七水合物0.5mg/L，共計9841.1524mg/L。
[0035]有機質(zhì)成分:葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽2mg/L、輕乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酹紅6mg/L、丙酮酸鈉100mg/L、次黃嘌呤2mg/L、亞油酸0.04mg/L、鹽酸丁二胺0.lmg/L、硫辛酸 0.lmg/L、胸苷 0.4mg/L,共計 9610.64mg/L。
[0036]蛋白質(zhì)成分:重組人血白蛋白3mg/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白60mg/L、重組人胰島素15mg/L重組人生長激素0.5mg/L,共計78.5mg/L。
[0037]助溶劑吐溫80為2mg/L。
[0038]實施例2
[0039]將實施例1中配制的培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量測試
[0040]I)無菌檢測
[0041]使用平板法檢測，取羊血瓊脂平板I塊和沙保弱瓊脂平板I塊，平衡至室溫。取實施例I中配制的培養(yǎng)基為樣品經(jīng)4000rpm離心15min后從樣品管底部吸取樣品，每塊平板ΙΟΟμ 1，用接種針劃線。將平板放入37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果為陰性，樣品合格。
[0042]2)內(nèi)毒素檢測
[0043]使用凝膠法檢測，取實施例1中配制的培養(yǎng)基為樣品經(jīng)稀釋后，同陰性對照、陽性對照、供試品陽性對照分別加入經(jīng)無菌檢查用水復(fù)融后的鱟試劑中，每種平行兩管。結(jié)果為陰性對照管為陰性，陽性對照管為陽性，供試品陽性對照管為陽性且樣品管為陰性，樣品合格。
[0044]3)支原體檢測為PCR法檢測
[0045]將實施例1中配制的培養(yǎng)基為樣品進(jìn)行沸水浴1min后經(jīng)12000rpm離心3min后使用，采用25 μ L體系對待測樣品、陽性對照、陰性對照進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察檢測結(jié)果。檢測結(jié)果為陰性，樣品合格。
[0046]實施例3
[0047]使用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離外周血單個核細(xì)胞，或者復(fù)蘇凍存的單個核細(xì)胞。生理鹽水500g離心5分鐘，去除上清液。計數(shù)細(xì)胞，用實施例1中配制的培養(yǎng)基配成濃度為I X 16個/mL細(xì)胞懸液。按每孔2mL培養(yǎng)基細(xì)胞懸液加入6孔板中，每組3個平行孔。第一天加入1000IU/mL的INF-r，放于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時后加入50ng/mL CD3單抗和500IU/mL IL-2。以后每隔48小時，補加所述培養(yǎng)基和500IU/mL IL-2，計數(shù)至IX 16個/mL細(xì)胞濃度。共培養(yǎng)18天觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)結(jié)果為:細(xì)胞形狀為多邊形，形態(tài)飽滿,生長良好。
[0048]實施例4
[0049]采用實施例3中的細(xì)胞培養(yǎng)方法，將免疫細(xì)胞的培養(yǎng)基更換成PRMI1640+10%FBS，標(biāo)記為A，PRMI 1640+人源性白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和生長激素，標(biāo)記為B，采用本專利的培養(yǎng)基，標(biāo)記為C，將本專利培養(yǎng)基的組分中的蛋白質(zhì)更換成人源性白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和生長激素，標(biāo)記為D。第15天時，臺盼藍(lán)染色計算細(xì)胞增值倍數(shù)和活率，結(jié)果分別如圖1和圖2所示。從圖中可看出，采用本發(fā)明配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的免疫細(xì)胞增值率和存活率都高于采用其他幾組。
[0050]實施例5
[0051]取培養(yǎng)第15天時免疫細(xì)胞懸液為樣品，2000rpm,離心lOmin。棄上清,加入適量生理鹽水，混勻。取適量EP管，做好標(biāo)記，將離心后混勻的細(xì)胞懸液分裝至1.5mL EP管中，每管0.5mL。每管中加入待測表型對應(yīng)的同型和抗體5ul，旋渦混合器振蕩30S，避光孵育30min。取出孵育好的試管,2000rpm離心lOmin。棄上清,再次加入500ul生理鹽水,混合均勻后，上機檢測，結(jié)果見圖3所示，從圖中可看出，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的免疫細(xì)胞的表型檢測結(jié)果明顯高于其他幾組，本發(fā)明的培養(yǎng)基對免疫細(xì)胞的培養(yǎng)具有特異性。
[0052]實施例6
[0053]實施例4中分離培養(yǎng)至15天的免疫細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，用實施例1中配制的的培養(yǎng)基洗滌I次，配制成I X 16個/mL細(xì)胞懸液。以K562細(xì)胞為靶細(xì)胞，用實施例1中配制的培養(yǎng)基洗滌I次，配制成密度為I X 15個/mL懸液。按效、靶細(xì)胞比10:1接種到96孔板中，37攝氏度、5%二氧化碳培養(yǎng)24小時。使用CCK-8試劑盒測吸光度值，計算殺瘤率。
[0054]殺瘤率％= 1_(試驗孔-效應(yīng)細(xì)胞孔)/(靶細(xì)胞孔-空白孔)，結(jié)果見圖4所示，從圖中看出，采用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的免疫細(xì)胞的殺瘤率明顯高于其他幾組。
[0055]以上所述為本發(fā)明的較佳實施例而已，但本發(fā)明不應(yīng)該局限于該實施例所公開的內(nèi)容。所以凡是不脫離本發(fā)明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中包括如下組分， 氨基酸為1400-1500mg，維生素為70_75mg，鹽類為9800-10000mg，有機質(zhì)為9500-9700mg，蛋白質(zhì)為 76_80mg。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述氨基酸為甘氨酸、L-精氨酸、L-門冬酰胺、L-天冬氨酸、L-鹽酸胱氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-羥脯氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-鹽酸賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物、L-纈氨酸、谷氨酰胺和丙氨酸二肽的組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述氨基酸中的各組分的濃度為甘氨酸17-19mg/L、L-精氨酸185_195mg/L、L-門冬酰胺40-45mg/L、L-天冬氨酸 15_20mg/L、L-鹽酸胱氨酸 55_60mg/L、L-谷氨酸 10_15mg/L、L-組氨酸 20-30mg/L、L-輕脯氨酸 10_15mg/L、L-異亮氨酸 120_130mg/L、L-亮氨酸 75_85mg/L、L-鹽酸賴氨酸95-105mg/L、L-蛋氨酸20_25mg/L、L-苯丙氨酸30_35mg/L、L-脯氨酸20-30mg/L、L-絲氨酸 40_50mg/L、L-蘇氨酸 25_35mg/L、L-色氨酸 10_20mg/L、L-酪氨酸二鈉鹽二水合物40-45mg/L、L-纈氨酸40_45mg/L、谷氨酰胺和丙氨酸二肽480_520mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述維生素為維生素H、氯化膽堿、泛酸鈣、葉酸、煙酰胺、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、維生素B12和肌醇的組合物；所述有機質(zhì)為葡萄糖、谷胱甘肽、羥乙基哌嗪乙硫磺酸、酚紅、丙酮酸鈉、次黃嘌呤、亞油酸、鹽酸丁二胺、硫辛酸、胸苷和吐溫80的組合物；所述蛋白質(zhì)為重組人血白蛋白、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白、重組人胰島素、重組人生長激素的組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述維生素中的各組分的濃度分別為維生素H 0.2-0.4mg/L、氯化膽堿0.8-1.2mg/L、泛酸隹丐2.5-3.5mg/L、葉酸4_6mg/L、煙酰胺8_12mg/L、對氨基苯甲酸0.4-0.6mg/L、鹽酸批P多醇1.1-1.3mg/L、鹽酸硫胺素 1.1-1.3mg/L、維生素 B120.01mg/L、肌醇 48_52mg/L ;所述有機質(zhì)中的各組分的濃度為葡萄糖3500mg/L、谷胱甘肽l_4mg/L、輕乙基哌嗪乙硫磺酸6000mg/L、酹紅5-7mg/L、丙酮酸鈉100mg/L、次黃嘌呤l_3mg/L、亞油酸0.04mg/L、鹽酸丁二胺0.1-0.2mg/L、硫辛酸 0.1-0.2mg/L、胸苷 0.4-0.6mg/L、吐溫 80 為 0_2mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述鹽類為硝酸鈣四水合物、硫酸鎂、氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、亞硒酸鈉五水合物、硫酸銅五水合物、硫酸亞鐵七水合物、氯化鎳、氯化亞錫二水合物、硫酸鋅七水合物的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述鹽類中的各組分的濃度為硝酸鈣四水合物70-85mg/L、硫酸鎂58_62mg/L、氯化鉀450-500mg/L> 碳酸氫鈉 2450_2550mg/L、氯化鈉 6000mg/L、磷酸氫二鈉 700mg/L、亞硒酸鈉五水合物0.13-0.16mg/L、硫酸銅五水合物0.002-0.003mg/L、硫酸亞鐵七水合物0.3-0.6mg/L、氯化鎳 0.0001-0.0002mg/L、氯化亞錫二水合物 0.0001-0.0002mg/L、硫酸鋅七水合物0.3-0.5mg/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述蛋白質(zhì)中的組合物濃度為重組人血白蛋白2-4mg/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白50-70mg/L、重組人胰島素12-16mg/L、重組人生長激素0.3-0.6mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基的PH值為6.8-7.2，保藏溫度為3-5°C。
10.權(quán)利要求1所述的無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的使用方法，其步驟包括:將需要培養(yǎng)的免疫細(xì)胞用生理鹽水離心，去除上清液；計數(shù)細(xì)胞，用無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞混勻制成濃度為I X 16個/mL的細(xì)胞懸液；按每孔2mL培養(yǎng)基細(xì)胞懸液加入6孔板中，加入1000IU/mL的INF_r干擾素，37°C培養(yǎng)24小時；加入50ng/mL CD3單抗和500IU/mL的IL-2 ;每隔48小時補加無動物蛋白源的免疫細(xì)胞無血清培養(yǎng)基和500IU/mL的IL-2，計數(shù)至I X 16個/mL細(xì)胞濃度，共培養(yǎng)13-15天。
【文檔編號】C12N5/0781GK104450614SQ201410737699
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月5日
【發(fā)明者】王曉明, 苗嘉奕, 金宜強 申請人:上海安集協(xié)康生物技術(shù)有限公司