一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法，采用組織塊貼壁法分離出羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，對(duì)P1-P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面陽(yáng)性分子和陰性分子并采用六孔板法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,本實(shí)驗(yàn)從胎盤(pán)羊膜組織中分離出細(xì)胞是hAMSCs，為進(jìn)一步研究hAMSCs的生物學(xué)和免疫學(xué)特性、分化能力、核型穩(wěn)定性，以及將其作為臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞等提供了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法，屬于醫(yī)療檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]胎盤(pán)是由胚胎的胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長(zhǎng)成的母子間交換物質(zhì)的過(guò)渡性器官，除含有滋養(yǎng)細(xì)胞外，還含有大量血管及間充質(zhì)成分；胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的從胎盤(pán)獲取的一類干細(xì)胞，與從臍帶血或骨髓中提取的干細(xì)胞相比較，不但干細(xì)胞數(shù)量多而且可分化成多種類的組織細(xì)胞，而且胎盤(pán)組織來(lái)源于產(chǎn)后，其收取過(guò)程對(duì)母體和新生兒不造成任何損傷，不受倫理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的限制，此外，研究人員從細(xì)胞表面抗原分析發(fā)現(xiàn)，胎盤(pán)間充質(zhì)干細(xì)胞是介于胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞之間的干細(xì)胞，由于其低免疫原性，不易被受體的免疫系統(tǒng)排斥，是理想的干細(xì)胞保存和利用的資源胎盤(pán)的構(gòu)造主要有3層(羊膜)絨毛膜和蛻膜，絨毛膜和蛻膜則富含血管和紅細(xì)胞，不易分離，羊膜是一層易于分離，且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的組織％如能從羊膜上分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，將是間充質(zhì)干細(xì)胞的一個(gè)良好供體，為研究者提供一個(gè)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的簡(jiǎn)便途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法，能從從體外成功分離培養(yǎng)出人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案
一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法，采用組織塊貼壁法分離出羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，對(duì)P1-P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面陽(yáng)性分子和陰性分子并采用六孔板法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
[0005]由于采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)將羊膜組織塊貼附在培養(yǎng)瓶上進(jìn)行培養(yǎng)7-10d后從組織塊周圍生長(zhǎng)出細(xì)胞，形態(tài)多樣，但以長(zhǎng)梭形為主，傳代后生長(zhǎng)迅速，呈流水狀生長(zhǎng)，3-6d達(dá)生長(zhǎng)高峰，這與骨髓MSCs的生長(zhǎng)特性一致；傳代至第3代，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞膜表面分子，結(jié)果顯示(細(xì)胞高表達(dá)⑶44、⑶105、⑶73HE⑶90，其表型特征與骨髓MSCs相似；說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)從胎盤(pán)羊膜組織中分離出細(xì)胞是hAMSCs，為進(jìn)一步研究hAMSCs的生物學(xué)和免疫學(xué)特性、分化能力、核型穩(wěn)定性，以及將其作為臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞等提供了基礎(chǔ)。

【具體實(shí)施方式】
[0006]下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0007]本發(fā)明的實(shí)施例:
I材料與方法
1.1 標(biāo)本來(lái)源胎盤(pán)取自健康足月新生兒剖宮產(chǎn)手術(shù)后，經(jīng)家屬知情同意并簽署《胎盤(pán)處理協(xié)議書(shū)》后捐獻(xiàn)所得。
[0008]1.2主要材料與儀器 1.2.1主要材料
透氣式細(xì)胞培養(yǎng)瓶(NEST)、無(wú)菌刻度吸管、六孔板、離心管、巴士得吸管、眼科剪、眼科鑷、手術(shù)剪、青霉素小瓶等。
[0009]1.2.2主要試劑
細(xì)胞培養(yǎng)液為L(zhǎng)-DMEM加10%FBS、0.25%胰蛋白酶、5.5%NaHC03、青-鏈酶素混合液等。
[0010]1.2.3主要儀器設(shè)備
超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)C02細(xì)胞培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、倒置顯微鏡、低溫冷凍離心機(jī)、正置顯微鏡等。
[0011]1.3 方法
1.3.1 hAMSCs分離培養(yǎng)
無(wú)菌條件下將靠近臍帶處的胎盤(pán)剪下，小心剝離羊膜，并用無(wú)菌生理鹽水(NS)清洗數(shù)次直至液體清亮，將其轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中用眼科剪剪成約l_2cm大小，用眼科鑷夾取并平鋪于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，沿培養(yǎng)瓶壁小心加入培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液既能覆蓋羊膜組織塊，又不至于使其漂浮起來(lái)，最后將培養(yǎng)瓶置于37度5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0012]1.3.2 hAMSCs 傳代培養(yǎng)
當(dāng)見(jiàn)組織塊周圍有細(xì)胞生長(zhǎng)后，每2d換液I次，當(dāng)細(xì)胞呈片狀生長(zhǎng)時(shí)，可用無(wú)菌PSB洗去羊膜組織塊；此后，隔日換液I次，細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)即可傳代；傳代時(shí)用無(wú)菌PSB液先洗；遍后，以去除殘留的培養(yǎng)液，然后用0.25%胰蛋白酶溶液(約1.5ml)于37度消化約3min,培養(yǎng)液中止消化，用巴士德吸管小心吹打細(xì)胞使其從培養(yǎng)瓶上脫落，轉(zhuǎn)移至15min離心管中，800r/min離心3min，棄上清，沉淀用培養(yǎng)液重懸，平均分配至2個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37度5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。
[0013]1.3.3 hAMSCs 表型鑒定
將分離傳代至P3代的細(xì)胞，按照流式檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明和步驟操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面分子，檢測(cè)的陽(yáng)性分子包括⑶73-AP、⑶90-FITC、⑶105_Cy5.5和陰性分子包括 CDllb-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE0
[0014]1.3.4 hAMSCs 增值實(shí)驗(yàn)
采用六孔板法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況P3代的細(xì)胞接種于六孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量1*103，置于37度5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液I次，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后每日取，孔細(xì)胞進(jìn)行胎盼藍(lán)染色，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，并繪制增殖曲線。
[0015]本發(fā)明通過(guò)將羊膜組織塊貼附在培養(yǎng)瓶上進(jìn)行培養(yǎng)7-10d后從組織塊周圍生長(zhǎng)出細(xì)胞，形態(tài)多樣，但以長(zhǎng)梭形為主，傳代后生長(zhǎng)迅速，呈流水狀生長(zhǎng)，3-6d達(dá)生長(zhǎng)高峰，這與骨髓MSCs的生長(zhǎng)特性一致；傳代至第3代，通過(guò)流式檢測(cè)細(xì)胞膜表面分子，結(jié)果顯示(細(xì)胞高表達(dá)⑶44、⑶105、⑶73HE⑶90，其表型特征與骨髓MSCs相似；說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)從胎盤(pán)羊膜組織中分離出細(xì)胞是hAMSCs，為進(jìn)一步研究hAMSCs的生物學(xué)和免疫學(xué)特性、分化能力、核型穩(wěn)定性，以及將其作為臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞等提供了基礎(chǔ)。
【權(quán)利要求】
1.一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法，其特征在于:采用組織塊貼壁法分離出羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，對(duì)P1-P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面陽(yáng)性分子和陰性分子并采用六孔板法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK104450612SQ201410741509
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】敖云霞 申請(qǐng)人:敖云霞