花生AhRRS22基因及其在煙草抗青枯病中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種花生青枯病抗性相關(guān)基因 AhRRS22 及其超表達(dá)載體的構(gòu)建及在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用，屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的花生抗性基因 AhRRS22 基因含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。通過(guò)構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) AhRRS22 基因植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，通過(guò)葉盤(pán)法將其導(dǎo)入翠碧一號(hào)煙草上，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行青枯菌的接種，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果證明提高了該轉(zhuǎn)基因?qū)煵莸目骨嗫莶⌒?。表明該基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的?yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】花生AhRRS22基因及其在煙草抗青枯病中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種花生青枯病抗性相關(guān)基因及其超表達(dá)載體的構(gòu)建及在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用，屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]花生ΛArachis hypogaea L.)是國(guó)際上重要的油、食兼用經(jīng)濟(jì)作物。花生青枯病是影響花生生產(chǎn)的重要病害，主要在長(zhǎng)江流域和南方地區(qū)造成嚴(yán)重危害，是花生品種必須檢驗(yàn)的病害。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)花生青枯病有向北蔓延趨勢(shì)，河南、山東均報(bào)道有青枯病發(fā)生(龐振鳳，2009)?；ㄉ嗫莶⊥ǔＧ闆r下引起減產(chǎn)10%-30%，嚴(yán)重時(shí)可造成50%以上甚至絕收。目前對(duì)植物青枯病尚無(wú)行之有效的化學(xué)藥劑防治辦法，被稱(chēng)為植物的“癌癥”，現(xiàn)主要采用栽培手段進(jìn)行控制，難以從根本上解決病害的發(fā)生；防治青枯病的根本手段還是培育抗病品種。實(shí)踐證明此抗病基因源對(duì)我國(guó)各地區(qū)不同類(lèi)型的青枯菌均具有廣譜抗性。因此，花生抗表枯病基因研究對(duì)解決花生等植物青枯病問(wèn)題具有重大意義。
[0003]隨著大規(guī)模測(cè)序和功能基因組學(xué)研究的深和發(fā)展，越來(lái)越多的植物與病原菌互作的分子機(jī)理被闡釋?zhuān)亲魑锴嗫莶〉目剐苑肿訖C(jī)理研究還處于初級(jí)階段。目前除擬南芥外在重要農(nóng)作物上還沒(méi)有獲得抗青枯病基因，對(duì)青枯菌侵染后植物的抗病反應(yīng)機(jī)制還不清晰，其涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究的還不透徹。通過(guò)大規(guī)模EST測(cè)序以及基因芯片技術(shù)能夠從一定水平上解析植物在病原菌脅迫下整個(gè)基因組水平的基因表達(dá)情況，從分子水平上剖析植物的抗病機(jī)理和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，發(fā)掘抗性相關(guān)基因以及開(kāi)發(fā)抗性相關(guān)的分子標(biāo)記等坐寸ο
[0004]隨著分子生物學(xué)和功能基因組學(xué)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)已經(jīng)成為高通量有效篩選差異基因表達(dá)的重要手段?；虮磉_(dá)譜芯片能夠提供很多重要信息比如不同組織器官和不同類(lèi)型的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組差別，不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段和病原菌侵染前后的基因表達(dá)差異，不同物種間或者同一物種不同個(gè)體之間的基因表達(dá)情況等。Luo等報(bào)道了花生受黃曲霉和干旱脅迫誘導(dǎo)的第一張cDNA芯片，這張芯片包括兩個(gè)生物和非生物脅迫的cDNA文庫(kù)中的384個(gè)unigenes，其中52個(gè)基因受黃曲霉和干旱誘導(dǎo)上調(diào)，42個(gè)基因只受干旱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)。Guo等在2011年報(bào)道了一個(gè)60-70mer的長(zhǎng)片段的核苷酸表達(dá)譜芯片，從中篩選受黃曲霉脅迫的相關(guān)基因。
[0005]本發(fā)明針對(duì)以上【背景技術(shù)】，在本實(shí)驗(yàn)室454測(cè)序獲得的大規(guī)模EST序列的基礎(chǔ)上，合成了自主研發(fā)含有101，344條unigenes的基因芯片,通過(guò)抗青枯病花生品種在接種青枯菌和非接種的mRNA與其雜交獲得了大量的基因表達(dá)差異的信息，對(duì)青枯菌誘導(dǎo)差異表達(dá)上調(diào)39倍的蓮因進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA的克隆，該基因的編碼產(chǎn)物定位在細(xì)胞膜上，其在煙草中超表達(dá)可顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯病的抗性，表明在植物應(yīng)答青枯病菌信號(hào)傳遞中起著重要的調(diào)節(jié)作用，這就為花生抗青枯病的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)現(xiàn)提供了一種受青枯菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的花生蓮因及其在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用，將大力促進(jìn)煙草抗青枯病基因工程的發(fā)展與應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了一種花生蓮因，該基因含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]花生蓮因能夠顯著提高煙草青枯病的抗性能力，這為花生抗青枯病的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。
[0009]本發(fā)明的花生AWP7P5.公基因主要通過(guò)抗青枯病花生品種在接種青枯菌和非接種的mRNA與其雜交獲得了大量的基因表達(dá)差異的信息，對(duì)青枯菌誘導(dǎo)差異表達(dá)上調(diào)39倍的基因進(jìn)行全長(zhǎng)cDNA的克隆，克隆全長(zhǎng)基因核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]本發(fā)明還提供了包含所述花生蓮因的超表達(dá)載體；以及，所述超表達(dá)載體的構(gòu)建方法:酶切連接替換植物表達(dá)載體PBI121-GUSA中的⑶S基因，構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AhRRS22基因的植物表達(dá)載體pBI121-AhRRS22-0E。
[0011]最后，本發(fā)明提供了所述的花生蓮因或所述的超表達(dá)載體在煙草等植物抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的花生AhRRS2龜因功能鑒定是通過(guò)酶切連接替換植物表達(dá)載體pBI 121-GUSA中的GUS基因，構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AhRRS2龜因植物表達(dá)載體pBI121-AhRRS22-0E,將其轉(zhuǎn)化EHA105農(nóng)桿菌，通過(guò)葉盤(pán)法將其導(dǎo)入翠碧一號(hào)煙草上，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行青枯菌的接種，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行抗性鑒定，結(jié)果證明提高了該轉(zhuǎn)基因?qū)煵莸目骨嗫莶⌒浴?br> [0013]本發(fā)明的花生蓮因超表達(dá)煙草相比野生型煙草對(duì)青枯病抗病能力顯著提高，表明該基因在植物抗青枯病基因工程中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為RACE獲得蓮因的3’未知序列和5’未知序列以及全長(zhǎng)cDNA的電泳圖；
圖2為過(guò)量表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證；
圖3為細(xì)胞定位結(jié)果；
圖4為在轉(zhuǎn)基因煙草中超表達(dá)對(duì)青枯病侵染的抗性。

【具體實(shí)施方式】
[0015]【實(shí)施例1】RACE獲得蓮因3’未知序列和5’未知序列
根據(jù)花生非生物和生物脅迫454測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組合成花生的表達(dá)譜基因芯片(羅氏公司合成)，利用抗青枯病品種接種前后芯片雜交篩選青枯菌誘導(dǎo)前后基因的差異表達(dá)獲得候選基因片段，設(shè)計(jì)一對(duì)基因引物 PRRS _22_F (5，-TGAGGTTGTCTGATCAGAGCACAG-3’)和PRRS_22-R (5’-GATCGAATAGTCTCCCTGTAAGGT-3，);再根據(jù)模板單鏈 cDNA 合成過(guò)程所加的接頭序列 RACE-F (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCAT)和 RACE-R (ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd (T) 30N-1N-3’)，利用 PRRS_22_R 引物和 RACE-F 引物以及 PRRS _22_F 引物和 RACE-R引物配對(duì)分別進(jìn)行V 和:V - RACE反應(yīng)，5' -RACE反應(yīng)條件是94°C 5min — (94°C30s ^ 60 °C 30s ^ 72 °C 2min) 30 cycles ^ 72 °C 1min ；3 ; -RACE 反應(yīng)條件是 94 °C5min— (94°C 30s ^ 72 °C 2min)5cycles — (94 °C 30s ^ 60 °C 30s ^ 72 °C 2min) 30cycles — 72°C 1min ;根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的目的條帶基因的大小對(duì)PCR產(chǎn)物有目的的回收連接進(jìn)行T-A克隆，陽(yáng)性克隆送華大基因有限公司測(cè)序。將獲得的5'和3'未知序列經(jīng)拼接后獲得其全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)cNDA引物AhRRS22_ FL_F(5’_TGACGCGATATCTGTAAAGTGTGA-3’)和 AhRRS22_FL_R (5， -AAGATACACTCAATTGAGATCTGC-3’)引物從單鏈cDNA擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)PCR產(chǎn)物有目的的回收連接進(jìn)行T-A克隆，陽(yáng)性克隆送華大基因有限公司測(cè)序并保存質(zhì)粒。蓮因的3’未知序列和5’未知序列以及全長(zhǎng)cDNA克隆的電泳圖如圖1所示；其全長(zhǎng)cDNA序列如SEQ ID N0.1所示。其全長(zhǎng)cDNA序列長(zhǎng)度為1795bp，編碼461個(gè)氨基酸，5’ -UTR長(zhǎng)度為40bp，3’ -UTR長(zhǎng)度為372bp，含有32bp poly (A)尾巴。
[0016]【實(shí)施例2】超表達(dá)載體構(gòu)建與驗(yàn)證
通過(guò) AhRRS22-0E-F (5 ’-ATTAGGATCCATGGCGGAAGCTTGGTTGTG-3’)和 AhRRS22_0E_R(5，-ATTTAGGCGCGCCTATCTAGCATCGATTAATTCCTTGAC-3，)這對(duì)弓 I物從具有完整讀碼框的質(zhì)粒中擴(kuò)增得到包括終止密碼的蓮因cDNA開(kāi)放閱讀框，5'端3'端分別帶有BamHl和Ascl酶切位點(diǎn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的由2XCaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pBI121_GUSA和擴(kuò)增得到的AhRRS22g的片段同時(shí)用BamHl (購(gòu)自NEB公司)和Ascl (購(gòu)自NEB公司)雙酶切，回收目的片段，用T4連接酶16°C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，構(gòu)建p35S::AhRRS22_0E超表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證以及酶切驗(yàn)證確定其載體構(gòu)建的正確性，其載體圖如圖2所示。通過(guò)液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105以備煙草轉(zhuǎn)基因用。
[0017]【實(shí)施例3】蓮因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位
對(duì)于亞細(xì)胞定位載體,通過(guò) AhRRS22-SL-F( 5，-ATTAGGATCCATGGCGGAAGCTTGGTTGTG-3，)和 AhRRS22-SL-R (5，-ATTTAGGCGCGCCATCTAGCATCGATTAATTCCTTGAC-3’)這對(duì)引物從具有完整讀碼框的質(zhì)粒中擴(kuò)增得到不包括終止密碼的蓮因cDNA，5'端3'端分別帶有BamHl和Ascl酶切位點(diǎn)，對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pBI_GFP和擴(kuò)增得到的蓮因同時(shí)用BamHl和Ascl雙酶切，經(jīng)過(guò)連接和轉(zhuǎn)化構(gòu)建p35S: 'AhRRS22..:GFP載體。通過(guò)液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，以p35S::GFP作對(duì)照，農(nóng)桿菌滲入法轉(zhuǎn)化本氏煙草，25°C培養(yǎng)48h后用熒光顯微鏡觀察綠色熒光(激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為532nm)。結(jié)果顯示AhRRS2遙因的編碼產(chǎn)物定位在細(xì)胞膜上(圖3所示)。
[0018]【實(shí)施例4】煙草的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定
采取根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草，把分別帶有質(zhì)粒P35S::AhRRS22-0E超表達(dá)載體的農(nóng)桿菌通過(guò)葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草品種翠碧一號(hào)(CB-1),用100mg/L卡那霉素(Kan)篩選葉芽及根系生長(zhǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中用500 mg/L頭孢霉素(Cef )來(lái)抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件溫度25 °C ±2°C，光照每天14h白天/1h黑夜。共培養(yǎng)培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+0.1mg/L NAA (a-萘乙酸)+ lmg/L 6-BA (6-芐氨基嘌呤)，，誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+0.1mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+ 100 mg/L kam +500mg/L Cef,生根培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基 +50mg/L Kan+500mg/L Cef。NAA, 6-BA, kan 和 Cef 購(gòu)自 Sigma 公司。
[0019]根據(jù)35S啟動(dòng)子和AhRRS2龜因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物引物35S-F (5 ’ -TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’ )和 AWPTdR (5，-CTGTGCTCTGATCAGACAACCTCA-3’)，CTAB 法提取轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因煙草DNA，以?xún)煞N轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，未轉(zhuǎn)化煙草DNA為對(duì)照，利用設(shè)計(jì)的35S-F和AhRRS22~R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為:10 X buffer 2.Ομ?，dNTP1.5Pl，35S_F 0.5μ1, AhRRS22~R 0.5μ1，Taq 酶 0.?μ?，ddH20 14.4μ1，模板 DNA 1.Ομ?，總體積為 20μ1。反應(yīng)程序?yàn)?94 V 5 min—(94 V 30 s — 57V 30 s — 72 V 60 s)40cycles — 72 °C 1min — hold at 4。。。
[0020]【實(shí)施例5】AWPTC表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的青枯病抗性鑒定
將獲得的轉(zhuǎn)基因煙草TO代抗病株系進(jìn)行套袋自交收獲Tl代轉(zhuǎn)基因種子，利用T2代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因煙草表型分析與功能鑒定。將T2代轉(zhuǎn)基因株系的種子以及野生型成熟種子分別種子無(wú)菌水浸泡24h，75%酒精30s，10%過(guò)氧化氫lOmin，無(wú)菌水清洗5_6次，播種MS培養(yǎng)上,十五天后,移栽于育苗盤(pán),一個(gè)月后選取大小一致的苗移栽于小花盆中培養(yǎng)9周后，對(duì)煙草種子進(jìn)行青枯菌葉脈注射接種處理，處理15后，超表達(dá)煙草植株相對(duì)于野生型對(duì)照表現(xiàn)出對(duì)病原菌侵染的明顯抗性，野生型煙草出現(xiàn)整株萎蔫甚至死亡。相同試驗(yàn)至少重復(fù)三次以上，均有同一趨勢(shì)結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯病菌明顯強(qiáng)于野生型對(duì)照(圖4)，說(shuō)明與了植物對(duì)青枯病菌的抗性作用。
【權(quán)利要求】
1.一種花生抗性基因，命名為蓮因，該基因含有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生抗性基因，其特征在于:所述的蓮因編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.包含如權(quán)利要求1所述花生抗性基因的超表達(dá)載體。
4.一種如權(quán)利要求3所述超表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:酶切連接替換植物表達(dá)載體pBI121-GUSA中的⑶S基因，構(gòu)建CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)AhRRS22基因的植物表達(dá)載體pBI121-AhRRS22-0E。
5.一種如權(quán)利要求1所述的抗性基因或權(quán)利要求3所述的超表達(dá)載體在煙草抗青枯病基因工程中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104498504SQ201410741527
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】張沖, 莊偉建, 陳華, 鄧燁, 蔡鐵城 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)