一種豬帶絳蟲tsol18基因重組卡介苗制備及鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬帶絳蟲TSOL18基因重組卡介苗制備及鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）質粒pMV261的擴增與鑒定；（2）重組質粒pMV261-TSOL18的構建及鑒定；（3）豬帶絳蟲TSOL18基因重組卡介苗的構建及鑒定：①BCG感受態(tài)細菌的制備；②重組質粒pMV261-TSOL18電轉化BCG感受態(tài)細菌；③豬帶絳蟲TSOL18基因重組卡介苗的鑒定：挑取上述陽性菌落中單個菌落至含Kana的M7H9ADC液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；取菌液，離心；棄上清，ddH2O洗滌，離心棄上清；加入ddH2O，重懸后沸水?。槐?，離心，吸取上清作為PCR模板，進行PCR鑒定。
【專利說明】一種豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗制備及鑒定方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明豬帶絳蟲TSOL18基因重組卡介苗制備及鑒定方法。

【背景技術】
[0002]豬囊尾呦病(Cysticercosiscellulosae)又稱囊蟲病(Cysticercosis)，是由豬帶絳蟲(Taenia solium)的中絳期幼蟲寄生在人體皮下、肌肉、腦、眼等臟器引起的一種嚴重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，我國也是豬囊尾呦病高發(fā)國家之一，以東北、華北、西北、西南地區(qū)發(fā)病率較高，全國約有200萬?300萬囊蟲病患者，感染率為0.14%?3.20%。藥物及手術治療都有其局限性，研制疫苗防治該病已成為當前研宄熱點。
[0003]TS0L18基因是豬帶絳蟲六鉤呦階段重要的免疫原基因，具有較好的免疫原性和抗原性，被認為是最具前景的疫苗候選基因?？ń槊?Bacillus Calmette_Gu6rin，BCG)是一種減毒牛型分支桿菌，廣泛用于結核病的預防。隨著基因工程技術的發(fā)展，選擇具有安全性和免疫佐劑作用的BCG作為載體，已在細菌、病毒、腫瘤、寄生蟲等領域構建了一系列基因工程疫苗。而在寄生蟲領域方面，尚未見豬帶絳蟲重組卡介苗的報道。


【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是:提供一種豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗制備方法，以解決現有技術中還沒有研宄出豬帶絳蟲重組卡介苗的問題。
[0005]本發(fā)明的技術方案是:一種豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗制備及鑒定方法，包括以下步驟:
(1)質粒PMV261的擴增與鑒定:先制備E.coli DH5 α感受態(tài)細胞，使用購買的pMV261質粒轉化E.coli DH5a感受態(tài)細胞，進一步擴增與鑒定，將鑒定正確的pMV261質粒進一步培養(yǎng)，留種并提取質粒備用；
(2)重組質粒pMV261-TS0L18的構建及鑒定:將載體pGEX_lλ T-TS0L18與質粒pMV261分別用BamH I和EcoR I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后，割取含所要回收DNA的瓊脂塊，放入到離心管中，回收并純化PCR產物；然后將膠回收的相應片段連接，連接產物轉化E.coli DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切、PCR和測序鑒定；
(3)豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗的構建及鑒定
①BCG感受態(tài)細菌的制備
1)取BCG菌液，接種于含有ADC的M7H9-TWeen80液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；
2)待0D600達到0.5-1.0 (對數生長期)時，冰浴，離心；
3)加入甘油，重懸，離心；
4)棄上清，重復步驟3);
5 )加入甘油，重懸混勻，待用；
②重組質粒PMV261-TS0L18電轉化BCG感受態(tài)細菌 1)在步驟①中制備的BCG感受態(tài)中加入步驟(2)中制備的重組質粒，混勻，冰浴靜置，轉移至電轉杯中，進行電擊；
2)轉化后加入M7H9ADC液體培養(yǎng)基，混勻后振蕩培養(yǎng)；
3)取上述混合液涂布于含有Kana的M7H9ADC固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)，篩選陽性菌落；
③豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗的鑒定:挑取上述陽性菌落中單個菌落至含Kana
的M7H9ADC液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；取菌液，離心；棄上清，ddH20洗滌，離心棄上清；加入dd H20，重懸后沸水??；冰浴，離心，吸取上清作為PCR模板，進行PCR鑒定。
[0006]電擊條件，電壓1800 V，間隔800 ms，脈沖150 μ S，共35次。其中constanttime設為5 ms ο
[0007]本發(fā)明的有益效果:通過酶切的方法，從載體pGEX-Ι λ T-TS0L18中獲得TS0L18基因，將該基因定向克隆到PMV261中，構建重組質粒pMV261-TS0L18，通過酶切、PCR和測序進行鑒定；將該重組質粒電轉化BCG，通過PCR進行鑒定；進一步在熱誘導下，使用SDS-PAGE分析和Western Blot鑒定TS0L18重組蛋白的表達情況，證明成功構建了豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗，并實現了該基因在BCG中的成功表達。本發(fā)明的疫苗是一種新型疫苗，具有許多優(yōu)點:所表達的靶抗原不需純化，可直接用于免疫注射，免去了蛋白質后處理的復雜工序；單次接種即可誘導機體產生針對靶抗原的免疫反應；運用分子生物學手段，通過對不同靶抗原的剪切和拼接，可使新型疫苗理想化；BCG本身作為一種強免疫佐劑，可提高宿主的免疫力；在人類近2X 109個免疫接種者中證明BCG用于人體是安全的；它是WHO推薦使用的兩種出生時即可接種的活疫苗之一；在世界范圍內分布著BCG接種網，價格低廉，易于保存，適于大量生產。因此，構建豬帶絳蟲重組卡介苗用于豬囊尾呦病防治可能具有十分誘人的前景，定會產生巨大的經濟和社會效益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為質粒pMV261測序鑒定圖譜；
圖2為pMV261空質粒單酶切鑒定圖譜，Lane M:Marker ；Lane 1:pMV261質粒；Lane 2:PMV261質粒Hind III單酶切；
圖 3 為 pGEX-1 λ T-TS0L18 質粒雙酶切鑒定圖譜，Lane M:Marker ；Lane I:pGEX-1 λ T-TSOL18 質粒 BamH I /EcoR I 酶切；
圖 4 為 pMV261-TS0L18 質粒 PCR 鑒定，Lane M -Marker ；Lane I:PCR 擴增產物；
圖 5 為 pMV261-TS0L18 質粒雙酶切鑒定圖譜，Lane M:Marker ；Lane I:pMV261-TS0L18質粒BamH I /EcoR I酶切；
圖6為pMV261-TS0L18質粒測序鑒定圖譜；
圖 7 為 pMV261-TS0L18 質粒轉化 BCG 菌落 PCR 檢測，Lane M -Marker ；Lane 1-7: 7 個克隆子的PCR檢測條帶；結果顯示1、3、4、5、6、7為陽性菌落；
圖8為BCG菌熱誘導檢測，Lane M:Marker ；Lane 12 3:分別為3、4、7號菌種熱誘導后總蛋白；Lane 4:野生型BCG囷總蛋白；
圖 9 為 BCG 菌熱誘導 Western blot 檢測(ant1-TS0L18_GST 抗體 1:1000 稀釋)，LaneM -Marker ；Lane I 2 3:分別為3、4、7號菌種熱誘導后總蛋白；Lane 4:野生型BCG菌總蛋白； 圖10為BCG菌熱誘導Western blot檢測(囊蟲病豬血清1:200稀釋)，Lane M:Marker ；Lane I 2 3:分別為3、4、7號菌種熱誘導后總蛋白；Lane 4:野生型BCG菌總蛋白。

【具體實施方式】
[0009]本發(fā)明的豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗制備及鑒定，包括以下步驟:
(I)質粒PMV261的擴增與鑒定:先制備E.coli DH5 α感受態(tài)細胞，使用購買的pMV261質粒轉化E.coli DH5a感受態(tài)細胞，進一步擴增與鑒定，將鑒定正確的pMV261質粒進一步培養(yǎng)，留種并提取質粒備用。
[0010](2)重組質粒PMV261-TS0L18的構建及鑒定:將制備保存的載體pGEX-1 AT-TS0L18與質粒pMV261分別用BamH I和EcoR I雙酶切，酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后，用干凈的手術刀在紫外燈下割取含所要回收DNA的瓊脂塊，放入到己知重量的1.5 ml離心管中，回收并純化PCR產物。然后將膠回收的相應片段16 °0過夜連接，連接產物轉化E.coli DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。
[0011](3)豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗的構建及鑒定 ①BCG感受態(tài)細菌的制備
1)取ImlBCG菌液，接種于含有10%ADC的M7H9_Tween80 (含0.05%)液體培養(yǎng)基中，37 0C 125 rpm 培養(yǎng)；
2)待0D600達到0.5-1.0 (對數生長期)時，冰浴2.5 h，5000 rpm離心5 min ；
3)加入20ml 4 °C預冷的10%甘油，重懸，離心；
4)棄上清，重復步驟3)；
5)加入初始培養(yǎng)物1/20體積預冷的10%甘油，重懸混勻，100μ I每管分裝于預冷的
1.5 ml離心管中；
6)_70°C待用。
[0012]②重組質粒pMV261-TS0L18電轉化BCG感受態(tài)細菌
1)從-70°C取出BCG感受態(tài)，迅速置于冰上融化，4 °C冰箱靜置約I h;
2)在ΙΟΟμΙBCG感受態(tài)中加入約5~15 μ g重組質粒，充分混勻，冰浴靜置10 min，轉移至0.1 cm電轉杯中；
3)在桌面上輕叩，使得細胞沉入杯底，加蓋置于電擊杯中；
4)預先設置電轉條件，電壓1800V，間隔800 ms，脈沖150 μ S，共35次。其中constanttime 設為 5 ms ；
5)轉化后立即加入Iml M7H9ADC液體培養(yǎng)基，輕輕混勻后轉移至玻璃試管內，37 V80 rpm振蕩培養(yǎng)5 h ；
6)取100μ I涂布于含有25 μ g/ml Kana的M7H9ADC固體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)約4~6周，篩選陽性菌落。
[0013]③豬帶絳蟲TS0L18基因重組卡介苗的鑒定:挑取上述平板中單個菌落至含25μ g/ml Kana的M7H9ADC液體培養(yǎng)基中，37 °C 150 rpm振蕩培養(yǎng)至0D600約1.0 ;取I ml菌液，10000 rpm離心10 min ;棄上清，ddH20洗滌3次，10000 rpm離心棄上清；加入30 μ I的dd H20，重懸后沸水浴10 min;冰浴2 min, 10000 rpm離心10 min，吸取上清作為PCR模板，進行PCR鑒定。
[0014](4)豬帶絳蟲TSOL18基因在BCG中的表達
1)從含25μ g/ml Kana的M7H9ADC固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落，接種于M7H9ADC液體培養(yǎng)基中；
2)37 0C 150 rpm培養(yǎng)約4周至對數生長期；
3)收集菌體前3天，每天45°C熱誘導45 min ；
4)6000 rpm, 4 °C離心15 min心收集沉淀，將沉淀重現于預冷的PBS中；
5)超聲破碎，冰浴中進行超聲破碎，每次4s (300 W)，間隔8 S，超聲約20 min ；
6)加入等體積的2XSDS上樣緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl, ρΗ6.8，10% 二硫蘇糖，4%SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油)，沸水浴4-8 min ；
7)用SDS-PAGE和Westernblot鑒定表達的重組蛋白。
【權利要求】
1.一種豬帶絳蟲130118基因重組卡介苗制備及鑒定方法，其特征在于:包括以下步驟: (1的擴增與鑒定:先制備￡.0011 0冊0感受態(tài)細胞，使用？靈261質粒轉化￡.0011 0115 0感受態(tài)細胞，進一步擴增與鑒定，將鑒定正確的？靈261質粒進一步培養(yǎng)，留種并提取質粒備用； (2)重組質粒1)17261-130118的構建及鑒定:將載體邱以-1X 1-130118與質粒？馭261分別用8^1111? I和2(301？ I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳后，割取含所要回收0嫩的瓊脂塊，放入到離心管中，回收并純化產物；然后將膠回收的相應片段連接，連接產物轉化￡.0011 0115 0感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切、？⑶和測序鑒定； (3)豬帶絳蟲130118基因重組卡介苗的構建及鑒定 ①8(?感受態(tài)細菌的制備 1)取8(?菌液，接種于含有虹X:的17119-1^661180液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)； 2)待00600達到0.5-1.0 (對數生長期)時，冰浴，離心； 3)加入甘油，重懸，離心； 4)棄上清，重復步驟3): 5 )加入甘油，重懸混勻，待用； ②重組質粒1)^261-130118電轉化8(?感受態(tài)細菌 1)在步驟①中制備的8(?感受態(tài)中加入步驟(2)中制備的重組質粒，混勻，冰浴靜置，轉移至電轉杯中，進行電擊； 2)轉化后加入1711940(:液體培養(yǎng)基，混勻后振蕩培養(yǎng)； 3)取上述混合液涂布于含有的1711940(:固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)，篩選陽性菌落；③豬帶絳蟲130118基因重組卡介苗的鑒定:挑取上述陽性菌落中單個菌落至含1?的的17冊八IX:液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)；取菌液，離心；棄上清，01冊20洗滌，離心棄上清；加入 重懸后沸水??；冰浴，離心，吸取上清作為模板，進行鑒定。
2.根據權利要求1所述的一種豬帶絳蟲130118基因重組卡介苗制備，其特征在于:電擊條件，電壓1800乂，間隔8001118，脈沖150 V 8，共35次，其中⑶仙仏!!“ 11116設為5咖。
【文檔編號】C12R1/32GK104498522SQ201410744426
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權日:2014年12月9日
【發(fā)明者】周必英, 楊鳳嬌, 江楠 申請人:遵義醫(yī)學院