一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒，包含擴(kuò)增預(yù)混液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的擴(kuò)增引物及SEQ ID NO:3的探針引物的混合物。本發(fā)明在PCR的基礎(chǔ)上，使用了探針?lè)?，只有?dāng)探針引物特異的結(jié)合到擴(kuò)增靶序列上并且PCR上游引物在有效延伸時(shí)，報(bào)告熒光基團(tuán)和猝滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光檢測(cè)系統(tǒng)才能接收到熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步；且該反應(yīng)始終都是閉管的實(shí)時(shí)檢測(cè)可以有效防止反應(yīng)產(chǎn)物的污染，與普通PCR方法相比具有更高的準(zhǔn)確性，有助于豬圓環(huán)病毒的防控和隱性帶毒動(dòng)物的剔除。
【專利說(shuō)明】 —種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及探針?lè)▽?shí)時(shí)-定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒，屬于豬圓環(huán)病毒防治【技術(shù)領(lǐng)域】，具體說(shuō)是一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒,本發(fā)明還包括該試劑盒的使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒病是以2_型圓環(huán)病毒(Porcine circovirus type 2,PCV2)為主要病原、單獨(dú)或繼發(fā)/混合感染其它致病微生物的一系列疾病的總稱。其感染與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的發(fā)生密切相關(guān)。致死率在1%?30%之間不等(Gillespie J, et al.，2009)，患病豬的主要臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、體重減輕、呼吸困難、黃疸、腹瀉、皮炎、淋巴結(jié)腫大、病毒血癥和免疫抑制，容易繼發(fā)感染如PRRSV (豬繁殖與呼吸綜合征)、PPV (豬細(xì)小病毒病)、豬肺炎支原體和豬鏈球菌等病原，造成機(jī)體多重感染。豬圓環(huán)病的感染呈世界性分布，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要病因之一。國(guó)外相繼有豬圓環(huán)病毒的檢測(cè)診斷試劑盒、但就目前市場(chǎng)供應(yīng)的各種豬圓環(huán)病的抗原檢測(cè)試劑盒，每頭份價(jià)格在20?80元人民幣之間，高昂的價(jià)格嚴(yán)重制約了豬圓環(huán)病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)及流行病學(xué)的普查工作。目前應(yīng)用相對(duì)較多的檢測(cè)技術(shù)為常規(guī)的PCR方法，該方法可直接從豬的脾臟、全血、淋巴結(jié)及肉品等中擴(kuò)增出預(yù)期的片斷，但是結(jié)果的觀察必須依賴于凝膠電泳，不但耗時(shí)長(zhǎng)，而且凝膠中的溴化乙錠是一種強(qiáng)的致癌物，對(duì)操作人員的健康具有一定的危害；并且豬圓環(huán)病是一種具有高度傳染性的病毒，其DNA(脫氧核糖核酸)特別容易發(fā)生變異。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，需要研制并開(kāi)發(fā)出快速，敏感、準(zhǔn)確以及價(jià)格低廉的豬圓環(huán)病毒檢測(cè)試劑盒。
[0003]核酸探針具有特定的序列，能夠與具有相應(yīng)核苷酸堿基互補(bǔ)序列的核酸片段結(jié)合，因此可用于樣品中特定基因片段的檢測(cè)。自90年代Taqman探針誕生以來(lái)，雖然熒光探針(引物)不斷有新的技術(shù)出現(xiàn)，但是作為一種經(jīng)典的定量PCR技術(shù)，Taqman探針技術(shù)仍然是許多實(shí)驗(yàn)研究人員進(jìn)行定量檢測(cè)的首選，這主要是因?yàn)橄鄬?duì)于SYBR熒光染料，Taqman探針具有序列特異性，只結(jié)合到互補(bǔ)區(qū)，而且熒光信號(hào)與擴(kuò)增的拷貝數(shù)同步進(jìn)行，因此特異性強(qiáng)、靈敏度高，而且條件優(yōu)化容易；而相對(duì)于雜交探針，Taqman探針只要設(shè)計(jì)一條探針，因此探針設(shè)計(jì)較便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。該技術(shù)是將常規(guī)PCR與熒光檢測(cè)相結(jié)合的技術(shù)，不僅具有敏感性高、特異性強(qiáng)、用時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，而且可通過(guò)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，結(jié)果更為準(zhǔn)確直觀，已成為病原體檢測(cè)的重要方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)不能適應(yīng)快速、敏感和準(zhǔn)確定量的檢測(cè)需求，從而提供一種能夠快速、敏感、準(zhǔn)確地檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒，本發(fā)明還提供該試劑盒的使用方法。
[0005]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案: 一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒,所述試劑盒包含擴(kuò)增預(yù)混液、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 2的擴(kuò)增弓I物和序列SEQ ID NO: 3的探針引物的混合物。
[0006]所述擴(kuò)增引物序列SEQ ID NO:1至SEQ ID N0:2為:
SEQ ID NO:1:上游引物 AAGCGGACCCCAACCACATAAA，
SEQ ID N0:2:下游引物 AGCGGGCACCCAAATACCACT。
[0007]所述探針引物序列為:
SEQ ID N0:3:GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。
[0008]所述擴(kuò)增弓丨物擴(kuò)增出的條帶序列為:
SEQ ID NO:4 (218 bp):
aagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttgtcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttctctaattttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgcto
[0009]所述陰性對(duì)照為無(wú)DNA酶水。
[0010]所述陽(yáng)性對(duì)照為含有PCV2基因序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-218 ;其構(gòu)建方式如下:
a.PCV基因組DNA的提取按QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit (凱杰公司脫氧核糖核酸提取試劑盒)說(shuō)明書進(jìn)行操作，以提取豬圓環(huán)病毒滅活疫苗基因組DNA為模板；以SEQID NO:1及SEQ ID NO: 2作為引物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2min ;94°C變性50s，56°C退火50s, 72°C延伸50s,共30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸1min, 4°C 5min。PCR產(chǎn)物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；
b.PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析:
PCR產(chǎn)物用AXYGEN(愛(ài)思進(jìn))公司的膠回收試劑盒回收，與pGMD-T_Easy克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上，37°C培養(yǎng)12?16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用AXYGEN質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列測(cè)定為陽(yáng)性的質(zhì)粒命名pGM-218。
[0011]其標(biāo)準(zhǔn)曲線制作如下:
對(duì)pGM-218陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，使其為=KT1?10_15，每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行定量PCR。
[0012]根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果從中選取5?6個(gè)點(diǎn)制作適合標(biāo)準(zhǔn)曲線要求的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所
/Jn ο
[0013]本發(fā)明還提供了所述用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
a.使用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件如下:94°C預(yù)變性2min ；94°C 20s，退火溫度 56°C 30 s，72°C 20 s，40 個(gè)循環(huán)。
[0014]b.結(jié)果分析:
根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:在NTC (陰性對(duì)照)沒(méi)有Ct (循環(huán)數(shù))值的情況下，Ct值〈35判為陽(yáng)性；Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值〈35為陽(yáng)性，Ct值> 35為陰性。
[0015]本發(fā)明通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)以及引物濃度和探針濃度的優(yōu)化，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2大于0.98 ;斜率位于-3?-3.5之間；PCR擴(kuò)增效率E位于0.9?1.2之間，符合線性關(guān)系、擴(kuò)增效率要求。其快速、靈敏、特異、定性、定量、低污染率等特點(diǎn)均優(yōu)于普通PCR方法。
[0016]本發(fā)明應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)研制和開(kāi)發(fā)出了特異性、敏感性和準(zhǔn)確性高及價(jià)格便宜的PCV2 Taqman Real-time PCR試劑盒，一方面可以彌補(bǔ)我國(guó)對(duì)于PCV2檢測(cè)的薄弱環(huán)節(jié)，同時(shí)有利于剔除陰性帶毒動(dòng)物。本發(fā)明在使用過(guò)程中無(wú)需電泳技術(shù)檢測(cè)，使得檢測(cè)時(shí)間由原來(lái)的3?4小時(shí)縮短到現(xiàn)在的I?2小時(shí)，并且避免了接觸溴化乙錠的危險(xiǎn)，有利于檢測(cè)人員的健康；同時(shí)本發(fā)明使用了探針?lè)?，只有?dāng)探針引物特異的結(jié)合到擴(kuò)增的靶序列并能被Taq酶降解時(shí)才會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)，而且閉管操作的實(shí)時(shí)檢測(cè)可以有效防止反應(yīng)產(chǎn)物的污染，使該方法與普通PCR方法相比具有更高的準(zhǔn)確性，有助于PCV的防控和隱性帶毒動(dòng)物的剔除，避免造成大范圍的傳染；本發(fā)明適用于待測(cè)豬的脾臟、全血、淋巴結(jié)、肉品及血清等樣品，所述方法適用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場(chǎng)等。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0018]圖1為本發(fā)明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為本發(fā)明樣本檢測(cè)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020]實(shí)施例1
1、引物的設(shè)計(jì)和制備:
參照GenBank (基因庫(kù))查找十株毒株，經(jīng)序列比對(duì)尋找每個(gè)序列上均保守的區(qū)域，選取保守區(qū)域并設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，一條探針引物，序列如下:
擴(kuò)增引物序列為:
SEQ ID NO:1:上游引物 AAGCGGACCCCAACCACATAAA,
SEQ ID NO: 2:下游引物 AGCGGGCACCCAAATACCACT。
[0021]探針引物序列為:
SEQ ID N0:3:GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。
[0022]上述引物由大連寶生物工程有限公司合成并進(jìn)行標(biāo)記。
[0023]陽(yáng)性對(duì)照:本發(fā)明試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所構(gòu)建并保存。
[0024]2、制備試劑盒:
本試劑盒由以下組分組成: a.2X擴(kuò)增預(yù)混液:12.5μ L ;
b.引物濃度均為lOpmol/μI的三條引物混合液3μ l，218bp上游引物1μ l，218bp下游引物Ιμ?，探針引物Ιμ? ；
C.無(wú) DNA/RNA 酶水 6.5 μ L ;
d.陽(yáng)性對(duì)照pGM-218陽(yáng)性質(zhì)粒3μ I ;
e.陰性對(duì)照無(wú)DNA酶水3μ I ;
3、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的使用方法:
(1)PCR總體系為25μ I。分別將本發(fā)明試劑盒中a.2X擴(kuò)增預(yù)混液12.5 μ L ；b.三條引物共3 μ I ；c.無(wú)DNA酶水6.5 μ I加入到0.2 ml擴(kuò)增管中；
(2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽(yáng)性對(duì)照3μ 1、從待檢豬脾臟中提取的DNA模板3 μ 1、陰性對(duì)照3μ l，12000rpm離心5?30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò)增:94°C預(yù)變性2min ;94°C 20s，退火溫度56°C 30 s，72°C 20 s，40個(gè)循環(huán)；直接在實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果；
4、結(jié)果分析:
根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:在NTC沒(méi)有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽(yáng)性；Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值〈35為陽(yáng)性，Ct值> 35為陰性。
[0025]實(shí)施例2
步驟I?2同實(shí)施例1 ;
3、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的使用方法:
(1)PCR總體系為25μ I。分別將本發(fā)明試劑盒中a.2X擴(kuò)增預(yù)混液12.5 μ L ；b.三條引物共3 μ I ；c.無(wú)DNA酶水6.5 μ I加入到0.2 ml擴(kuò)增管中；
(2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽(yáng)性對(duì)照3μ 1、從待檢豬全血中提取的DNA模板3 μ 1、陰性對(duì)照3μ l，12000rpm離心5?30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò)增:94°C預(yù)變性2min; 94°C 20s，退火溫度56°C 30 s，72°C 20 s，40個(gè)循環(huán)；直接在實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果；
4、結(jié)果分析:
根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:在NTC沒(méi)有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽(yáng)性；Ct值介于35?40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值〈35為陽(yáng)性，Ct值> 35為陰性。
[0026]實(shí)施例3
步驟I?2同實(shí)施例1 ;
3、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的使用方法:
(1)PCR總體系為25μ I。分別將本發(fā)明試劑盒中a.2X擴(kuò)增預(yù)混液12.5 μ L ；b.三條引物共3 μ I ；c.無(wú)DNA酶水6.5 μ I加入到0.2 ml擴(kuò)增管中；
(2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽(yáng)性對(duì)照3μ 1、從待檢豬淋巴結(jié)中提取的DNA模板3μ 1、陰性對(duì)照3 μ 1，12000rpm離心5?30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò)增:94°C預(yù)變性2min ;94°C 20s，退火溫度56°C 30 s，72°C 20 s，40個(gè)循環(huán)；直接在實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果；
4、結(jié)果分析:
根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:在NTC沒(méi)有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽(yáng)性；Ct值介于35?40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值〈35為陽(yáng)性，Ct值> 35為陰性。
[0027]實(shí)施例4
步驟I?2同實(shí)施例1 ;
3、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的使用方法:
(1)PCR總體系為25μ I。分別將本發(fā)明試劑盒中a.2X擴(kuò)增預(yù)混液12.5 μ L ；b.三條引物共3 μ I ；c.無(wú)DNA酶水6.5 μ I加入到0.2 ml擴(kuò)增管中；
(2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽(yáng)性對(duì)照3μ 1、從待檢豬肉品中提取的DNA模板3 μ 1、陰性對(duì)照3μ l，12000rpm離心5?30秒，將擴(kuò)增管放入擴(kuò)增儀中，在以下設(shè)定程序下擴(kuò)增:94°C預(yù)變性2min ;94°C 20s，退火溫度56°C 30 s，72°C 20 s，40個(gè)循環(huán)；直接在實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增儀上觀察擴(kuò)增結(jié)果；
4、結(jié)果分析:
根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:在NTC沒(méi)有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽(yáng)性；Ct值介于35?40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值〈35為陽(yáng)性，Ct值> 35為陰性。
[0028]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒,包含擴(kuò)增預(yù)混液、陰性對(duì)照，其特征在于:還包含陽(yáng)性對(duì)照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 2的擴(kuò)增引物和序列SEQ ID N0:3的探針引物的混合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的TaqmanReal-time PCR試劑盒，其特征在于:所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 2為:
SEQ ID NO:1:上游引物 AAGCGGACCCCAACCACATAAA， SEQ ID N0:2:下游引物 AGCGGGCACCCAAATACCACT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的TaqmanReal-time PCR試劑盒，其特征在于:所述探針引物序列為:
SEQ ID N0:3:GTGGGTGTTCACGCTGAATAATCCTTCCG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的TaqmanReal-time PCR試劑盒，其特征在于:所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 2的擴(kuò)增引物和序列SEQ ID NO: 3的探針引物濃度均為lOpmol/yL，擴(kuò)增引物及探針引物配比為1:1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的TaqmanReal-time PCR試劑盒，其特征在于:所述擴(kuò)增引物擴(kuò)增出的條帶序列為: 序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延長(zhǎng)的序列；
SEQ ID NO:4 (218 bp):
aagcggaccccaaccacataaaaggtgggtgttcacgctgaataatccttccgaagacgagcgcaagaaaatacgggagctcccaatctccctatttgattattttattgttgtcgaggagggtaatgaggaaggacgaacacctcacctccaggggttctctaattttgtgaagaagcaaacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgcto
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的TaqmanReal-time PCR試劑盒，其特征在于:所述探針引物的5’端標(biāo)記物為FAM報(bào)告熒光基團(tuán)、3’端標(biāo)記物為TAMRA淬滅熒光基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的TaqmanReal-time PCR試劑盒，其特征在于:所述陽(yáng)性對(duì)照為構(gòu)建的PGM-218陽(yáng)性質(zhì)粒以及利用其制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該質(zhì)粒是擴(kuò)增引物SEQ ID N0:^PSEQ ID NO: 2所擴(kuò)增的豬圓環(huán)病毒基因序列，長(zhǎng)度218bp，克隆至pGEM-T Easy克隆載體，篩選為陽(yáng)性的命名為pGM_218，即陽(yáng)性對(duì)照，利用陽(yáng)性對(duì)照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的TaqmanReal-time PCR試劑盒，其特征在于:所述試劑盒組分的配比為: a.2 X擴(kuò)增預(yù)混液:25份; b.引物濃度均為1pmol/μ I的三條引物混合液6份，218bp上游引物2份，218bp下游引物2份，探針引物2份； c.無(wú)RNA/DNA酶水13份； d.陽(yáng)性對(duì)照pGM-218陽(yáng)性質(zhì)粒6份； e.陰性對(duì)照無(wú)DNA酶水6份。
9.一種如權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的Taqman Real-time PCR試劑盒的使用方法，其特征在于:包括以下步驟: a.使用權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件如下:94°C預(yù)變性2min ；94°C.208，退火溫度 561 308, 7200 208，40 個(gè)循環(huán)； 匕結(jié)果分析； 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定:在沒(méi)有以值的情況下，以值〈35判為陽(yáng)性；以值介于35?.40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)；再次測(cè)定時(shí)該樣品以值〈35為陽(yáng)性，以值? 35為陰性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104388593SQ201410745685
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】劉湘濤, 田宏, 吳錦艷, 陳妍, 尚佑軍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所