一種通過添加葡萄糖酸提高乙偶姻產(chǎn)量的方法
【專利摘要】添加葡萄糖酸提高乙偶姻產(chǎn)量的方法，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。利用本實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的高產(chǎn)乙偶姻野生型枯草芽孢桿菌B.subtilis JNA(保藏號(hào)CCTCC M209309；專利申請(qǐng)公布號(hào)CN 101864381A)進(jìn)行發(fā)酵，通過調(diào)節(jié)葡萄糖與葡萄糖酸的比例改變胞內(nèi)輔酶變化水平從而改變乙偶姻與2,3-丁二醇比例。最終在較低NADH濃度及NADH/NAD+比例下(50g/L葡萄糖和50g/L葡萄糖酸)，轉(zhuǎn)化約為55.8g/L的乙偶姻，副產(chǎn)物2,3-丁二醇僅為4.1g/L；與使用葡萄糖作為唯一碳源相比較，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.78g/(L·h)，乙偶姻產(chǎn)量提高近86％，副產(chǎn)物2,3-丁二醇積累量下降80％。為國(guó)內(nèi)外首次利用混合還原態(tài)底物降低NADH濃度及其NADH/NAD+比例發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，實(shí)現(xiàn)了提高生產(chǎn)效率、減少NADH依賴型副產(chǎn)物的目的。
【專利說明】一種通過添加葡萄糖酸提高乙偶姻產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加葡萄糖酸，降低發(fā)酵前期副產(chǎn)物2，3- 丁二醇的積累，提高乙偶姻的產(chǎn)量，本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]乙偶姻在食品調(diào)香、生化及藥理方面有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其合成和生產(chǎn)都有著比較深入的研究。自然界中的某些細(xì)菌具有生產(chǎn)乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌屬(Klebisella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)以及乳球菌屬(Lactococcus)等。但是在大多數(shù)菌株代謝過程中，乙偶姻是作為2，3-丁二醇和丁二酮代謝的副產(chǎn)物而存在的，積累濃度較低，從而直接導(dǎo)致了難以利用這些微生物菌種工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。
[0003]本實(shí)驗(yàn)室保藏有一株以葡萄糖為底物高產(chǎn)乙偶姻的枯草芽孢桿菌(保藏號(hào)CCTCCM2093092009.12.21 ;專利申請(qǐng)公布號(hào)CN 101864381 A)，在搖瓶發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵過程中乙偶姻和2，3-丁二醇相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象:在以150g/l葡萄糖為底物的前提下，發(fā)酵前期主要積累2，3- 丁二醇；發(fā)酵中期(96h左右)2，3- 丁二醇含量達(dá)到最高值約43g/L，乙偶姻約為15g/L，此時(shí)乙偶姻和2，3-丁二醇含量比例大約為1:3 ;發(fā)酵后期伴隨著菌體老化裂解大部分形成芽孢等現(xiàn)象，中間代謝產(chǎn)物乙偶姻開始積累，到發(fā)酵終止時(shí)(144h)乙偶姻和2，3-丁二醇含量比例大約為3:1，此時(shí)它們含量分別為39.5g/L和14g/L左右，導(dǎo)致乙偶姻產(chǎn)量無法進(jìn)一步提高。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前期由于受到糖酵解途徑影響，乙偶姻需轉(zhuǎn)化成2，3- 丁二醇為細(xì)胞生長(zhǎng)提供所需的NAD+，導(dǎo)致2，3- 丁二醇大量積累，NADH濃度上升。因此考慮通過改變底物還原態(tài)，從而改變胞內(nèi)NADH水平和NADH/NAD+比例來調(diào)控乙偶姻及2，3- 丁二醇的生成。通過利用葡萄糖酸發(fā)酵，減少糖酵解途徑代謝，降低NAD+需求，實(shí)現(xiàn)降低NADH水平和NADH/NAD+比例。
[0004]本發(fā)明通過調(diào)節(jié)葡萄糖與葡萄糖酸的比例改變胞內(nèi)輔酶變化水平從而改變乙偶姻與2，3- 丁二醇比例。利用葡萄糖為底物促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)利用葡萄糖酸為底物降低NADH水平和NADH/NAD+比例，最終達(dá)到提高生產(chǎn)效率，減少NADH依賴型副產(chǎn)物2，3- 丁二醇的目的，實(shí)現(xiàn)高效發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所使用的菌種為B.subtilis JNA,該菌株前期發(fā)酵葡萄糖合成2，3_ 丁二醇，后期逆向轉(zhuǎn)化為乙偶姻，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為=CTCCM209309。
[0006]本發(fā)明的主要研究?jī)?nèi)容:本發(fā)明根據(jù)研究B.subtilis JNA發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻的過程中的NADH及NAD+變化，通過調(diào)節(jié)葡萄糖與葡萄糖酸的比例改變輔酶變化水平從而改變乙偶姻與2，3-丁二醇比例。最終在一個(gè)較低NADH濃度及NADH/NAD+比例下(50g/L葡萄糖和50g/L葡萄糖酸)發(fā)酵72h，轉(zhuǎn)化約為55.8g/L的乙偶姻，副產(chǎn)物2，3- 丁二醇僅為4.1g/L較原始菌株下降80%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.78g/(L.h)，產(chǎn)量提高近86%。
[0007]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0008](I)本發(fā)明首次報(bào)道了通過利用不同還原態(tài)底物調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH水平和NADH/NAD+比例來減少NADH依賴型副產(chǎn)物的生成，為枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻減少NADH依賴型副產(chǎn)物提供了一定的理論可能。
[0009](2)本發(fā)明通過調(diào)節(jié)葡萄糖與葡萄糖酸的比例改變輔酶變化水平從而改變乙偶姻與2，3- 丁二醇比例。，將50g/L葡萄糖和50g/L葡萄糖酸轉(zhuǎn)化約為55.8g/L的乙偶姻副產(chǎn)物，2，3- 丁二醇僅為4.lg/L較原始菌株下降80%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.78g/(L.h)，產(chǎn)量提高近86%。

【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1:B.subtilis JNA發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻胞內(nèi)輔酶變化檢測(cè)
[0011]⑴種子培養(yǎng)
[0012]從活化平板上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12h左右，種子培養(yǎng)基組成:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L 葡萄糖 40g/L。
[0013]⑵發(fā)酵培養(yǎng)
[0014]初始發(fā)酵培養(yǎng)體積為2L，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:牛肉浸膏5g/L，玉米漿20g/L，尿素2g/L，葡萄糖100g/L。將上述發(fā)酵培養(yǎng)基用5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH至6.5，在121°C下高溫滅菌30min。
[0016]發(fā)酵條件:將上述培養(yǎng)好的種子液按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度37°C，空氣流量為120m3/h.m3培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min。定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞濃度、乙偶姻和2，3- 丁二醇及其它NADH依賴型副產(chǎn)物的產(chǎn)量。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中產(chǎn)物2，3- 丁二醇和乙偶姻用氣相色譜測(cè)定(GC-1690J氣相色譜儀，杭州科曉化工儀器公司)。色譜條件如下:毛細(xì)管柱，30mX0.32mm色譜柱中固定液為AT.SE-30，檢測(cè)器為FID，柱溫150°C，汽化室與檢測(cè)器的溫度均為250°C，載氣為N2,流速0.1Mpa,進(jìn)樣量2 μ L，采用外標(biāo)法定量。
[0017](3)胞內(nèi)輔因子水平測(cè)定
[0018]重組菌株胞內(nèi)輔因子水平檢測(cè)利用AAT B1quest公司試劑檢測(cè)盒。通過熒光酶標(biāo)儀，在 Ex/Em = 540/590nm 下檢測(cè) NADH、NAD+ 濃度和 NADH/NAD+ 比例。
[0019]結(jié)果表明，發(fā)酵前期受到糖酵解途徑影響，乙偶姻轉(zhuǎn)化為2，3-丁二醇為細(xì)胞提供所需的NAD+，導(dǎo)致2，3- 丁二醇大量積累，NADH濃度上升。
[0020]實(shí)施例2:混合葡萄糖與葡萄糖酸發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻、2，3- 丁二醇及副產(chǎn)物性能檢測(cè)
[0021](I)種子培養(yǎng)
[0022]從活化平板上挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)時(shí)間為12h左右，種子培養(yǎng)基組成:酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl10g/L 葡萄糖 40g/L。
[0023](2)發(fā)酵培養(yǎng)
[0024]初始發(fā)酵培養(yǎng)體積為2L，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基成分如下:
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基成分:牛肉浸膏5g/L，玉米漿20g/L，尿素2g/L，葡萄糖/葡萄糖酸(9:1,3:7,5:5,7:3,9:1) 100g/Lo將上述發(fā)酵培養(yǎng)基用5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH至6.5，在121 °C下高溫滅菌30min。
[0026]發(fā)酵條件:將上述培養(yǎng)好的種子液按5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度37°C，空氣流量為120m3/h.m3培養(yǎng)基，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min。定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞濃度、乙偶姻和2，3- 丁二醇及其它NADH依賴型副產(chǎn)物的產(chǎn)量。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中產(chǎn)物2，3- 丁二醇和乙偶姻用氣相色譜測(cè)定(GC-1690J氣相色譜儀，杭州科曉化工儀器公司)。色譜條件如下:毛細(xì)管柱，30mX0.32mm色譜柱中固定液為AT.SE-30，，檢測(cè)器為FID，柱溫150°C，汽化室與檢測(cè)器的溫度均為250°C，載氣為N2,流速0.1Mpa,進(jìn)樣量2 μ L，采用外標(biāo)法定量。
[0027]最終B.subtilis JNA在一個(gè)較低NADH濃度及NADH/NAD+比例下(50g/L葡萄糖和50g/L葡萄糖酸)，轉(zhuǎn)化約為55.8g/L的乙偶姻，副產(chǎn)物2，3- 丁二醇僅為4.lg/L較原始菌株下降80%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.78g/(L.h)，產(chǎn)量提高近86%。
【權(quán)利要求】
1.一種發(fā)酵策略應(yīng)用于提高乙偶姻的產(chǎn)量，其特征是:利用葡萄糖和葡萄糖酸作為混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻，利用葡萄糖為底物促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)利用葡萄糖酸為底物降低胞內(nèi)NADH水平和NADH/NAD+比例，從而提高乙偶姻產(chǎn)量。
2.權(quán)利要求1所述發(fā)酵策略在發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻中的應(yīng)用，其特征是:B.subtilis JNA接種于10mL LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)7-9h后，取1ml轉(zhuǎn)接于2瓶50ml含40g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中37°C振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)至0D_ = 5.0-6.0時(shí)，加入含1.9L發(fā)培酵養(yǎng)基的.5L發(fā)酵反應(yīng)器中培養(yǎng)，最終發(fā)酵72h，在一個(gè)較低NADH濃度及NADH/NAD+比例下，轉(zhuǎn)化約為.55.8g/L的乙偶姻，副產(chǎn)物2，3-丁二醇僅為4.lg/L較原始菌株下降80%，乙偶姻生產(chǎn)效率上升到0.78g/(L *h)，與使用葡萄糖作為唯一碳源相比，乙偶姻產(chǎn)量提高86% ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:牛肉浸膏5g/L,玉米衆(zhòng)20g/L,尿素2g/L,50g/L葡萄糖和50g/L葡萄糖酸，去尚子水配置，pH6.5。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK104404089SQ201410748883
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】饒志明, 包騰, 張顯, 趙曉靜, 楊套偉, 徐美娟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)