一種用于餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的生物炭固定化酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種可用于高酸值餐廚廢棄油脂轉(zhuǎn)化生物柴油的殼聚糖修飾生物炭基固定化酶的制備方法。將花生殼等生物質(zhì)在限氧條件下高溫?zé)崃呀獬啥嗫捉Y(jié)構(gòu)的生物炭，采用具有良好生物兼容性的殼聚糖進一步修飾生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)，通過殼聚糖大分子之間互相交聯(lián)產(chǎn)生立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，促進脂肪酶分子在基質(zhì)載體上的固定，改善固定化酶的催化活性與穩(wěn)定性。采用該方法制備的固定化脂肪酶催化活性得到充分提高，所制備的固定化酶可用于高酸值餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的催化體系。
【專利說明】一種用于餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的生物炭固定化酶及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶固定化【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種可用于餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的殼聚糖修飾生物炭固定化脂肪酶的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國城市化進程不斷推進，城市餐廚垃圾污染負荷日益增加，其中廢棄油脂由于環(huán)境暴露和處置不當(dāng)，對城市環(huán)境衛(wèi)生和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前，餐廚垃圾的處理方式主要包括直接粉碎作為飼料或直接提取廢油脂再利用、作為生活垃圾進行焚燒、填埋、好氧堆肥、厭氧消化等。其中，厭氧消化技術(shù)由于既可實現(xiàn)餐廚垃圾的減量化與無害化，又能實現(xiàn)高值化利用，因而受到了廣泛關(guān)注。通過厭氧消化工藝，餐廚垃圾中有機廢棄物轉(zhuǎn)化為生物能源沼氣，同時產(chǎn)生的沼液可用作肥料，而沼渣還可制備成去除重金屬、有機污染物的生物炭/活性炭，這種“以廢治廢”的資源化途徑具有廣闊的應(yīng)用空間。但由于餐廚垃圾成分復(fù)雜，其中油脂類物質(zhì)含量通常較高(水和油脂占總量的70~80%)，高油脂含量為餐廚垃圾的后續(xù)處理與資源化利用帶來諸多問題，如油脂發(fā)酵產(chǎn)生致癌物黃曲霉素、干擾微生物活動、堵塞厭氧反應(yīng)器管路等。近年來，餐廚廢油的環(huán)境衛(wèi)生與資源/能源轉(zhuǎn)化研宄已成為公眾、研宄學(xué)者以及各級政府關(guān)注的焦點。一些城市餐廚廢油被提煉成“地溝油”，經(jīng)非法渠道重回到餐桌，帶來嚴(yán)重的食品安全隱患。而另一方面，餐廚廢油是放錯位置的資源/能源。我國人口眾多，餐廚廢油產(chǎn)量豐富，將其回收再轉(zhuǎn)化為生物柴油已被認(rèn)為是一條充滿應(yīng)用前景的可再生能源發(fā)展途徑。因此，餐廚垃圾的深度處理和高值化利用應(yīng)綜合考慮環(huán)境安全、廢物資源化利用以及生物質(zhì)能源的再生與可持續(xù)發(fā)展。
[0003]事實上，餐廚廢油的主要成分是甘油三酯，這類廢油脂在催化劑作用下可與短鏈醇通過轉(zhuǎn)酯化和酯化反應(yīng)合成脂肪酸短鏈酯，即生物柴油。目前，國內(nèi)外利用餐廚廢油催化制備生物柴油的途徑主要包括酸堿催化法、超臨界醇化法和生物酶法。其中，生物酶法催化制備生物柴油被公認(rèn)為是一種環(huán)保節(jié)能的技術(shù)。生物酶法是以脂肪酶為催化劑，在非水溶液體系中催化動植物油脂(脂肪酸甘油三酯)與短鏈醇合成脂肪酸單烷基酯，這種催化合成方法具有原料預(yù)處理簡單、醇用量少、能耗低、產(chǎn)物分離回收方便以及環(huán)境友好等優(yōu)點。然而，游離的脂肪酶催化活性和使用壽命不足限制了其在催化制備生物柴油中的應(yīng)用。許多策略如脂肪酶分子修飾和酶固定化技術(shù)已經(jīng)被用于改善脂肪酶在非水溶液體系中的催化活性和穩(wěn)定性。酶固定化技術(shù)由于能提高脂肪酶的催化穩(wěn)定性和重復(fù)使用效率，明顯降低酶催化工藝的成本，因而已成為制備生物柴油的關(guān)鍵技術(shù)之一。此外，生物炭是一種低成本、多功能的環(huán)保材料，已廣泛用于環(huán)境污染物修復(fù)、退化土壤改良、以及溫室氣體減排等領(lǐng)域。目前有關(guān)生物炭載體用于固定化脂肪酶的研宄，尤其是應(yīng)用于城市餐廚廢棄油脂轉(zhuǎn)化生物柴油的相關(guān)技術(shù)或研宄尚不多見。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]因此，針對以上內(nèi)容，本發(fā)明提供一種殼聚糖修飾生物炭基固定化脂肪酶的制備方法，采用該方法進行處理的新型酶催化劑可用于高酸值餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的催化工
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[0005]為達到上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:一種殼聚糖修飾生物炭基固定脂肪酶的制備方法，包括以下步驟:將花生殼等生物質(zhì)在限氧條件下高溫?zé)崃呀獬啥嗫捉Y(jié)構(gòu)的生物炭，采用具有良好生物兼容性的殼聚糖溶液進一步修飾生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)，添加戊二醛溶液使殼聚糖大分子之間互相交聯(lián)并合成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，促進脂肪酶分子在基質(zhì)載體上的固定，改善固定化酶的催化活性與穩(wěn)定性。采用該方法制備的固定化脂肪酶催化活性得到充分提高，可用于高酸值餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的催化體系。
[0006]進一步的改進是:所述生物炭是在限氧或低氧條件下熱裂解而成，熱裂解溫度范圍400-850°C，所述生物炭為花生殼生物炭、菜籽殼生物炭、水稻殼生物炭以及秸桿生物炭中的任意一種。
[0007]進一步的改進是:按以下方法對脂肪酶進行固定:采用具有良好生物兼容性的殼聚糖溶液修飾生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)，添加戊二醛溶液使殼聚糖大分子之間互相交聯(lián)并產(chǎn)生立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，從而促進脂肪酶分子在基質(zhì)載體上的固定；所述殼聚糖溶液濃度為0.5?5wt%，戊二醛溶液濃度為I?10wt%。
[0008]進一步的改進是:所述脂肪酶為伯克霍爾德菌脂肪酶、豬胰脂肪酶、假單胞菌脂肪酶、假絲酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶中的任意一種。
[0009]上述制備方法的固定化脂肪酶也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0010]通過采用前述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明采用殼聚糖生物大分子修飾生物炭基質(zhì)的孔隙結(jié)構(gòu)，通過生物兼容性大分子的表面修飾過程有利于穩(wěn)定脂肪酶分子的催化活性，進一步的，采用了戊二醛溶液使殼聚糖大分子之間互相交聯(lián)并產(chǎn)生立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，充分提高了固定化脂肪酶的穩(wěn)定性與催化活性。
[0011]本發(fā)明具有以下特點:1)、以生物炭作為酶固定化基質(zhì)，其生物質(zhì)原料可再生、成本低廉，規(guī)?；瘧?yīng)用過程簡單、可操作性強；2)、采用生物兼容性殼聚糖分子修飾酶固定化基質(zhì)，添加戊二醛溶液使殼聚糖大分子之間互相交聯(lián)并合成立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，有利于脂肪酶催化活性的穩(wěn)定與反復(fù)再利用；3)、殼聚糖修飾生物炭基固定化脂肪酶明顯提高了酶催化活性，可用于高酸值餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的催化工藝，且易于回收再利用、應(yīng)用成本低廉。

【具體實施方式】
[0012]以下將結(jié)合具體實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，借此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達成技術(shù)效果的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。
[0013]若未特別指明，實施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明。
[0014]本發(fā)明的實施例為:
一種殼聚糖修飾的生物炭固定化脂肪酶的制備方法，具體操作步驟如下:1)將花生殼等生物質(zhì)浸于水中，去除灰塵、雜質(zhì)后，置于80°C烘箱中干燥，粉碎過100目篩，裝入帶蓋的坩禍并轉(zhuǎn)移至馬弗爐中，以10°C /min的升溫速率加熱到850°C，限氧熱裂解4h，冷卻到室溫后，再水洗-抽濾-干燥，所得產(chǎn)物即為生物炭基質(zhì)。2)配置生物炭與脂肪酶溶液、殼聚糖溶液、以及戊二醛溶液的混合體系，該體系中殼聚糖大分子可對生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)進一步修飾，通過戊二醛使殼聚糖分子之間互相交聯(lián)產(chǎn)生立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，促進脂肪酶在修飾生物炭基質(zhì)上固定并保持較高催化活性。脂肪酶溶于磷酸緩沖液(pH7, 50mmol/L)，充分溶解后，離心去除雜質(zhì)，收集酶上清液，用于酶固定化。用50ml的0.lmol/L鹽酸配置成1%的的殼聚糖溶液，30°C下攪拌至完全溶解之后，將所配置的殼聚糖溶液與酶、生物炭混合，再加入lwt%的戊二醛溶液，25°C下恒溫振蕩，之后真空抽濾，并反復(fù)用磷酸緩沖液洗滌，收集沉淀物，_50°C冷凍干燥，即獲得固定化脂肪酶。
[0015]測定固定化酶催化酯水解活性的操作步驟如下:
配置16.5mmol/L的棕櫚酸對硝基苯醋的2-異丙醇溶液，取Iml所配置底物溶液于圓底燒瓶，與9ml的磷酸緩沖液、0.2ml的曲拉通χ-100和1mg阿拉伯膠混勻，25_50°C下恒溫預(yù)培養(yǎng)30min，投入脂肪酶，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。在選定時間分取一定量反應(yīng)液，用預(yù)冷的去離子水稀釋，離心后取上清液在410nm處比色分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算得樣品中對硝基苯酚的濃度。脂肪酶催化酯水解活性單位定義為在上述條件下單位時間內(nèi)催化釋放I微摩爾對硝基苯酚所需的酶量。實驗結(jié)果表明，與游離的脂肪酶相比，本發(fā)明所制備的殼聚糖修飾生物炭固定化脂肪酶顯示較高的催化活性。
[0016]測定固定化酶催化制備生物柴油的操作步驟如下:
為了評估本發(fā)明所制備固定化酶在高酸值餐廚廢棄油脂轉(zhuǎn)化生物柴油催化工藝中的應(yīng)用潛力，考察了固定化脂肪酶對典型游離脂肪酸(以油酸為例)酯化過程的催化效果。具體是，分別稱取4克油酸與0.4克水于圓底燒瓶中混合，按醇油摩爾比2:1加入甲醇溶劑，按酶用量占油總量比例的5%加入所制備的固定化酶，在40 °C下以200rpm的轉(zhuǎn)速振蕩反應(yīng)，定期采集反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)離心、加熱去甲醇后，分取上層油相并用正己烷稀釋，加入十六烷作為內(nèi)標(biāo)，通過GC-MS分析脂肪酸甲酯的產(chǎn)量。氣相色譜柱的規(guī)格為30mX0.25mmX0.25 μm(型號19091S -433)，柱箱升溫程序如下:初始溫度50°C，保留2 min后以8°C/min升溫到175°C，以4°C /min升溫到215°C，再以20°C /min升溫到270°C，保留3min ;后運行溫度2800C，后運行時間2min，最高柱箱溫度設(shè)定為310°C，進樣口溫度250°C。載體為氦氣，流速設(shè)定為lml/min，每次進樣量為I μ 1，進樣采用不分流模式，分流出口吹掃流量20ml/min。質(zhì)譜條件:EI離子源，質(zhì)量掃描范圍40-600m/z。生物柴油的轉(zhuǎn)化率(T%)按以下公式計算，Τ%=(脂肪酸甲酯實際產(chǎn)量/脂肪酸甲酯理論產(chǎn)量)Χ100。實驗結(jié)果表明，殼聚糖修飾的生物炭固定化酶催化油酸制備生物柴油是可行的，生物柴油的最高轉(zhuǎn)化效率在90%以上。
[0017]以上所記載，僅為利用本創(chuàng)作技術(shù)內(nèi)容的實施例，任何熟悉本項技藝者運用本創(chuàng)作所做的修飾、變化，皆屬本創(chuàng)作主張的專利范圍，而不限于實施例所揭示者。
【權(quán)利要求】
1.一種可用于餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的殼聚糖修飾生物炭固定化脂肪酶及其制備方法，其特征在于，將花生殼等生物質(zhì)在限氧條件下高溫?zé)崃呀獬啥嗫捉Y(jié)構(gòu)的生物炭，采用具有良好生物兼容性的殼聚糖進一步修飾生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)，通過殼聚糖大分子之間互相交聯(lián)產(chǎn)生立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，促進脂肪酶分子在基質(zhì)載體上的固定，改善固定化酶的催化活性與穩(wěn)定性，采用該方法制備的固定化脂肪酶催化活性得到充分提高，可用于高酸值餐廚廢油轉(zhuǎn)化生物柴油的催化體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述生物炭是在限氧或低氧條件下熱裂解而成，熱裂解溫度范圍400-850°C，所述生物炭為花生殼生物炭、菜籽殼生物炭、水稻殼生物炭以及秸桿生物炭中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，按以下方法對脂肪酶進行固定:采用具有良好生物兼容性的殼聚糖溶液修飾生物炭的孔隙結(jié)構(gòu)，添加戊二醛溶液使殼聚糖大分子之間互相交聯(lián)并產(chǎn)生立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)材料，從而促進脂肪酶分子在基質(zhì)載體上的固定；所述殼聚糖溶液濃度為0.5?5wt%，戊二醛溶液濃度為1?10wt%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于:所述脂肪酶為伯克霍爾德菌脂肪酶、豬胰脂肪酶、假單胞菌脂肪酶、假絲酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、曲霉脂肪酶中的任意一種。
【文檔編號】C12N11/10GK104450668SQ201410749333
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】胡朝華, 萬順剛, 張又弛, 羅文邃 申請人:中國科學(xué)院寧波城市環(huán)境觀測研究站, 中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所