一種來源于Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶編碼基因melC及其蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株鏈霉菌Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶的編碼基因melC及其蛋白。Streptomyces kathirae SC-1是本實驗室前期篩選獲得的一株高產(chǎn)黑色素菌株，目前該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2012432。本發(fā)明過程最終克隆獲得1899bp，該序列包括553 bp開放閱讀框上游序列、酪氨酸酶操縱子melC(包括兩個編碼基因melC1及melC2)，melC1基因產(chǎn)物為酪氨酸酶金屬伴侶，其功能為激活酪氨酸酶原，運輸銅離子至酪氨酸酶，幫助酪氨酸酶至細胞外。與國內(nèi)外已報道酪氨酸酶編碼基因進行對比，發(fā)現(xiàn)其與已報道的最高相似度僅為75％，其編碼的氨基酸序列與已報道的最高相似度僅為83％，說明Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶編碼基因是一種新型酪氨酸酶。CCTCC NO: M 201243220121103
【專利說明】-種來源于Streptomyces kath i rae SCM的酪氨酸酶編碼 基因 melC及其蛋白

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從Streptomyces kathirae SC-I中克隆該酪氨酸酶編碼基因，屬于基 因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。 技術(shù)背景
[0002] 隨著有關(guān)人造黑色素的致癌、致病的報道不斷增多，人們?nèi)找骊P(guān)注人造色素對人 體造成的危害。人們對色素的生物安全性的關(guān)注度越來越高。天然的黑色素是非均質(zhì)多 酚類聚合體，以酪氨酸為底物，由酪氨酸酶催化后生成L-多巴、多巴鉻等，而后經(jīng)過一系列 非酶催化的氧化反應(yīng)最終生成黑色素。黑色素廣泛存在于動植物和微生物中，與生物自我 保護機制有關(guān)。有研究表明，天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合陽離 子（例如有毒的重金屬）、新型的藥物載體、作為治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾 病，例如著色性干皮病、帕金森氏癥、老年性癡呆癥、亨廷氏舞蹈病等，有報道指出，可溶性 的黑色素在體外具有抗HIV的活性，為治療艾滋病開辟了一個新途徑。目前黑色素生產(chǎn)主 要為動植物提取和采用化學(xué)法以酪氨酸為原料生產(chǎn)，這兩種方法成本高、工藝繁瑣，使黑色 素因價格昂貴而限制其大規(guī)模的生產(chǎn)與應(yīng)用。微生物所產(chǎn)的黑色素是由其體內(nèi)的酪氨酸酶 催化酪氨酸形成的多巴類黑色素，是氨基酸的衍生物，具有無毒、無害等特點，而且產(chǎn)黑色 素的微生物種類繁多，生產(chǎn)工藝簡單，易于操作，不受時間與地域的限制，因此用微生物來 生產(chǎn)黑色素具有巨大的優(yōu)勢。
[0003] Streptomyces kathirae SC-I是本實驗室前期篩選獲得的一株高產(chǎn)黑色素菌 株，目前該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為=CCTCC M 2012432,與國 內(nèi)外已報道產(chǎn)黑色素鏈霉菌16Sr RNA進行對比，發(fā)現(xiàn)其最高相似度僅為95. 37%，說明 Streptomyces kathirae SC-I是一株新型產(chǎn)黑色素鏈霉菌，對產(chǎn)黑色素關(guān)鍵酶酪氨酸酶進 行分離純化獲得電泳純酪氨酸酶，并且通過基因工程手段獲得該酪氨酸酶編碼基因，與國 內(nèi)外已報道酪氨酸酶編碼基因進行對比，發(fā)現(xiàn)其最高相似度僅為75%，說明Sti^ptomy ces kathirae SC-I酪氨酸酶編碼基因是一種新型酪氨酸酶，使用變鉛青鏈霉菌驗證克隆獲得 基因的功能，拓展了微生物生產(chǎn)黑色素資源。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了一個新的酪氨酸酶及其基因，該酪氨酸酶基因序列與國內(nèi)外已報道 的最高相似度僅為75%，其編碼氨基酸序列與國內(nèi)外已報道的最高相似度僅為83%。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0006] (1)將Streptomyces kathirae SC-1接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，8000g離心收集發(fā) 酵液去菌絲體。
[0007] (2)在冰浴的條件下，向發(fā)酵液中添加硫酸銨至其飽和度為65%沉淀酪氨酸酶蛋 白，繼續(xù)攪拌發(fā)酵液20分鐘后12000g離心Ih后小心棄其上清，收集蛋白沉淀，使用Buffer A重懸酶蛋白。
[0008] (3)步驟（2)的酶蛋白溶液經(jīng)透析得到蛋白樣品溶液，過Q Sephrose FF離子交換 層析柱，先用Buffer A洗脫至無蛋白流出，在用洗脫液Buffer B梯度洗脫，獲得高純度酪 氨酸酶。
[0009] (4)使用MS鑒定并測定純化酪氨酸酶部分氨基酸序列，根據(jù)MS獲得的氨基酸序列 設(shè)計引物，克隆了部分酪氨酸酶編碼基因，其主要特點是：
[0010] 上游引物其基因型為：TCCCCCTCGTTCCTGCCCTGGCACCG ;
[0011] 下游引物其基因型為：GGTGCCGCCGAGGAAGTCGGGCGCCC ;
[0012] 酪氨酸酶編碼基因的PCR擴增條件為：94°C預(yù)變性5min ;95°C變性45s，69°C退火 30s，72°C延伸30s，反應(yīng)25個循環(huán)；
[0013] 將PCR擴增之后的產(chǎn)物經(jīng)過載體連接并送至上海生物工程有限公司測序。
[0014] (5)步驟⑷獲得的部分基因序列，設(shè)計引物，應(yīng)用TAIL-PCR擴增已知基因片段兩 端序列，其主要特點是：
[0015] 使用SP1-6結(jié)合AD引物擴增已知基因片段3'端基因序列，使用SP7-12結(jié)合AD 引物擴增已知基因片段5'端基因序列；

【權(quán)利要求】
1. 一種Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶的編碼基因melC及其蛋白， Streptomyces kathirae SC-1是本實驗室前期篩選獲得的一株高產(chǎn)黑色素菌株，目前該菌 株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC M 2012432。
2. 權(quán)利要求1所述的鏈霉菌菌株所產(chǎn)酪氨酸酶的分離純化方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 將Streptomyces kathirae SC-1接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，8000g離心收集發(fā)酵液 去菌絲體； (2) 在冰浴的條件下，向發(fā)酵液中添加硫酸銨至其飽和度為65%沉淀酪氨酸酶蛋白， 繼續(xù)攪拌發(fā)酵液20分鐘后12000g離心lh后小心棄其上清，收集蛋白沉淀，使用Buffer A 重懸酶蛋白； (3) 步驟⑵的酶蛋白溶液經(jīng)透析得到蛋白樣品溶液，過Q Sephrose FF離子交換層析 柱，先用Buffer A洗脫至無蛋白流出，在用洗脫液Buffer B梯度洗脫，獲得高純度酪氨酸 酶蛋白； 其中所述Buffer A含有pH8. 00. 05M Tris-HCl緩沖液；所述Buffer B含有 pH8. 00. 05MTris-HCl、lMNaCl 緩沖液。
3. 權(quán)利要求2所述的酪氨酸酶分離純化方法獲得純酪氨酸酶部分基因片段擴增引物：TCCCCCTCGITCCTGCCCTGGCACCG 及 GGTGCCGCCGAGGAAGTCGGGCGCCC 進行 PCR 擴增獲得部分 酪氨酸酶基因片段；擴增條件為：94°C預(yù)變性5min ;95°C變性45s，69°C退火30s，72°C延伸 30s，反應(yīng)25個循環(huán)，4°C保存。
4. 利用權(quán)利要求3所獲得的酪氨酸酶基因片段，使用TAIL-PCR獲得新的酪氨酸酶全 基因，其特征是包括553bp開放閱讀框上游序列、酪氨酸酶操縱子melC (包括兩個編碼基因 melCl及melC2)，melCl大小為375bp，ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子，編碼124個 氨基酸，蛋白大小為12. 9kDa，在32-33處含有信號肽切割位點Ala-Ala，melC2基因產(chǎn)物為 酪氨酸酶，melC2大小為822bp，ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子，編碼273個氨基酸， 蛋白大小為30. 8kDa，獲得的新的酪氨酸酶基因序列與已報道的酪氨酸酶基因序列相似性 最尚為75%。
5. 權(quán)利要求4所述的酪氨酸酶基因，其特征在于，將酪氨酸酶編碼基因的功能驗 證表達質(zhì)粒PIJ86-C2及pIJ86-melCl-C2通過引物設(shè)計melCIF、melC2F及melCR以 Streptomyces kathirae SC-1基因組為模板，PCR擴增目的基因。
6. 權(quán)力要求5所述的引物序列及用途，其特征在于， 引 物 me 1C 1 F : CTAAAGCTTATGCCGGAACTCACCCGCCG 及 me 1 CR ： CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC 用于擴增 melCl-C2 串聯(lián)基因片段；引物 melC2F : CTAAAGCTTATGACCGTACGCAAGAACCAG 及 melCR :CGCAGATCTTCAGACGTCGAACGTGTAGAAC 用于擴 增melC2基因片段。
7. 如權(quán)利要求5所述的酪氨酸酶基因PCR擴增條件，其特征在于，95°C預(yù)變性5min ; 97°C變性45s, 69°C退火30s, 72°C延伸1. 5min，反應(yīng)25個循環(huán)。
8. 如權(quán)利要求5所述的酪氨酸酶基因編碼的蛋白，其特征在于，melCl基因產(chǎn)物為酪 氨酸酶金屬伴侶，其功能為激活酪氨酸酶原，幫助酪氨酸酶至細胞外；melC2基因產(chǎn)物為酪 氨酸酶，獲得的新的酪氨酸酶氨基酸序列與已報道的酪氨酸酶氨基酸序列相似性最高為 83%。
【文檔編號】C12N15/53GK104404064SQ201410749427
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】饒志明, 郭靜, 楊套偉, 徐美娟, 張顯, 滿在偉 申請人:江南大學(xué)