一種細(xì)胞可逆分選載體及其在細(xì)胞可逆分選中的應(yīng)用和方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種細(xì)胞可逆分選載體，所述載體包括特異性抗體、海藻酸鈉和磁珠，所述海藻酸鈉包裹所述磁珠，所述抗體通過生物素-親和素系統(tǒng)與所述海藻酸鈉鏈接，且所述抗體還鏈接有待分選細(xì)胞，結(jié)構(gòu)簡單，易于制備，本發(fā)明還公開了所述細(xì)胞分選載體在細(xì)胞分選中的應(yīng)用和方法，能夠解決常規(guī)的篩選后，磁珠始終鏈接在細(xì)胞上，或者磁珠脫離極其耗時且會有其他干擾的問題。
【專利說明】一種細(xì)胞可逆分選載體及其在細(xì)胞可逆分選中的應(yīng)用和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是指一種細(xì)胞可逆分選載體，本發(fā)明還涉及一種細(xì)胞可逆分選載體在細(xì)胞分選中的應(yīng)用和方法。

【背景技術(shù)】
[0002]不同的細(xì)胞表面會有不同的抗原，傳統(tǒng)的細(xì)胞篩選技術(shù)就是用磁珠和對應(yīng)的抗體連在一起，當(dāng)特定的抗體和其對應(yīng)的細(xì)胞表面的抗原結(jié)合的時候，就形成了細(xì)胞+抗體+磁珠復(fù)合體，然后用磁場就可以把細(xì)胞+抗體+磁珠復(fù)合體從各種細(xì)胞中篩選出來。
[0003]但是傳統(tǒng)的技術(shù)，篩選出來的是一個細(xì)胞+抗體+磁珠復(fù)合體，雖然磁珠的粒徑等都較小，但仍然會對細(xì)胞的生長、分化等產(chǎn)生一定的影響，從而造成對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，如果涉及到藥物的輸送與釋放，也會產(chǎn)生一定的影響。
[0004]因此，為充分利用到磁珠的磁性對于篩選的優(yōu)勢，同時能夠在篩選以后將磁珠分離，成為一個需要重視的問題，有一些文獻(xiàn)中提到，基于磁珠的成分屬性(主要成分是氧化鐵和多聚糖)，從而利用生物降解，達(dá)到消除磁珠的目的，這一方法在一定程度上行的通，但實(shí)際上這一過程耗時長，而且，需要生物降解，就必須要重新添加如新的酶或者菌株，這對于細(xì)胞培養(yǎng)等來說，又是新的污染，產(chǎn)生新的影響，因此實(shí)際的可行度并不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出一種細(xì)胞可逆分選載體，能夠充分利用磁珠的磁性對細(xì)胞進(jìn)行篩選，完成后還能將磁珠進(jìn)行脫離，消除磁珠對細(xì)胞培養(yǎng)等的影響。
[0006]本發(fā)明還提出了一種細(xì)胞可逆分選載體在細(xì)胞可逆分選中的應(yīng)用和方法，簡單易行，便于實(shí)驗(yàn)室的推廣與使用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種細(xì)胞可逆分選載體，所述載體包括特異性抗體、海藻酸鈉和磁珠，所述海藻酸鈉包裹所述磁珠，所述抗體通過生物素-親和素系統(tǒng)與所述海藻酸鈉鏈接，并且所述抗體還鏈接有待分選的細(xì)胞，從而形成了由“磁珠+海藻酸鈉+抗體+細(xì)胞”的復(fù)合結(jié)構(gòu)，另外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的一般知識，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計等的需要，所述抗體也可以為二抗，也能實(shí)現(xiàn)到需要的效果。
[0008]進(jìn)一步，所述抗體偶聯(lián)b1tin (生物素)，所述海藻酸鈉偶聯(lián)SA (鏈霉親和素)，所述抗體與所述海藻酸鈉通過所述b1tin與所述SA之間的偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈接。采用鏈霉親和素SA和b1tin作為中間的偶聯(lián)因子，具有提高結(jié)合強(qiáng)度的效果。
[0009]生物素-親和素是一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)，其具有高度專一性，穩(wěn)定性，靈敏性等特點(diǎn)，而受到廣泛應(yīng)用，而其中，B1tin和SA之間的鏈接更是普遍采用的，鏈接非常緊密的一種方式，從而能夠具有更好的實(shí)驗(yàn)效果。
[0010]進(jìn)一步，所述載體通過以下方法制備:
(一)將海藻酸鈉包被磁珠； (二)將包被磁珠后的海藻酸鈉偶聯(lián)SA；
(三)將抗體偶聯(lián)b1tin(生物素)；
(四)將SA與步驟(三)中的b1tin進(jìn)行偶聯(lián)。
[0011]用SA-海藻酸鈉標(biāo)記磁珠后SA上有4個b1tin的結(jié)合位點(diǎn)，這樣就可以結(jié)合4個標(biāo)記了 b1tin的抗體，相對于抗體標(biāo)記的磁珠抓細(xì)胞更緊些，效果更好。
[0012]中國專利CN 1872028A中公開了 “一種免疫磁性納米微球及其制備方法和用途”，其中的“磁性納米微球”的結(jié)構(gòu)為“以生物可降解高分子材料為高分子包裹層，包裹層內(nèi)包含緩釋藥物和納米磁性材料，表層鏈接有單克隆抗體”，另外，還提到該可降解高分子材料選自瓊脂糖、殼聚糖、葡聚糖、海藻酸鈉中的一種或其組合。但是縱觀該專利所公開的全部內(nèi)容，其利用磁珠的磁性相應(yīng)解決了定向藥物聚集，并利用高分子材料(其中包含有海藻酸鈉)解決藥物緩釋的問題，兩者屬于不同的應(yīng)用領(lǐng)域，并且采用的技術(shù)手段，達(dá)到的技術(shù)效果，結(jié)果的技術(shù)問題全都不同，另外，根據(jù)本發(fā)明后面說明的在細(xì)胞可逆分選的過程中，對于海藻酸鈉這一組分精準(zhǔn)挑選，是不可替代的，即上述專利工公開的其他高分子材料不可替換的，因此具有極高的創(chuàng)造性，更進(jìn)一步，上述專利中提到的組分緩釋藥物，也是不可缺少的必要組分。
[0013]一種細(xì)胞可逆分選載體在細(xì)胞分選中的應(yīng)用。
[0014]一種細(xì)胞可逆分選的方法，采用了所述細(xì)胞可逆分選載體。
[0015]進(jìn)一步，所述細(xì)胞可逆分選的方法，包括如下步驟:
1.收集并充分懸浮待分離細(xì)胞；
i1.將待分離細(xì)胞與可細(xì)胞逆分選載體特異性結(jié)合；
ii1.將步驟ii中得到的結(jié)合物放入到位于磁場中的分離柱中進(jìn)行初步分離，得到陽性結(jié)合的細(xì)胞；
iv.加入EDTA(乙二胺四乙酸)進(jìn)行深度分離，海藻酸鈉與抗體之間的分離，并得到表面鏈接抗體的細(xì)胞的拆分體，并分離和收集拆分體；
上述步驟中，通過利用本發(fā)明公開的所述細(xì)胞可逆分選載體，應(yīng)用到細(xì)胞可逆分選的過程中，同常規(guī)利用磁珠載體的過程相比，在完成了細(xì)胞初步分離，獲得陽性結(jié)合細(xì)胞后，極具創(chuàng)造性的增添了步驟iv，在添加EDTA后，其能夠特異的打斷海藻酸鈉與抗體之間的鏈接，從而實(shí)現(xiàn)將由海藻酸鈉包裹的磁珠與鏈接有抗體的細(xì)胞進(jìn)行分離，然后通過磁珠的磁性等將磁珠、海藻酸鈉和拆分體進(jìn)行完全分離篩選。
[0016]關(guān)于EDTA分離抗體和海藻酸鈉的成因在于:在鈣離子(交聯(lián)劑)存在的條件下，海藻酸鈉會包裹在磁珠表面，EDTA可以絡(luò)合鈣離子而讓海藻酸鈉脫落下來。
[0017]進(jìn)一步，步驟i中包括以下過程:離心收集待分離細(xì)胞，用少量PBE (戊巴比妥)孵育液，包括:0.5%BSA (牛血清白蛋白)、0.08%EDTA,PH7.2 PBS (磷酸緩沖液)，真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體，充分懸浮細(xì)胞，達(dá)到約0.5mL / 1*108細(xì)胞。
[0018]進(jìn)一步，步驟ii中包括以下過程:加入一抗和表面包裹有海藻酸鈉的超微磁珠，取1(Γ20 μ g/ml終濃度，混勻后置4?15°C孵育20?30分鐘。
[0019]進(jìn)一步,步驟iii中，包括如下步驟:
a)將分離柱安裝入磁場中，加入0.5mL PBE,在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱； b)將孵育完畢的細(xì)胞懸浮液加到分離柱中，自然流盡；
c)以0.5mL PBE加入到分離柱中，自然流盡，洗柱一次；
d)從磁場中取下分離柱，插在試管口上，加入f2mLPBE，用針芯用力推盡液體，沖出陽性結(jié)合的細(xì)胞。
[0020]進(jìn)一步，步驟iV中，包括以下過程:加入0.05?0.2mol/L的EDTA溶液2ml，在500(T8000rpm下離心10分鐘，棄去上清液，得到細(xì)胞沉淀，重復(fù)三次，得到陽性細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗一次。
[0021]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提出了一種細(xì)胞可逆分選的載體，比常規(guī)的磁珠載體創(chuàng)造性的增加了一層海藻酸鈉，將所述可逆分選載體應(yīng)用到細(xì)胞的可逆分選上，結(jié)合EDTA的作用，實(shí)現(xiàn)在篩選出目標(biāo)細(xì)胞后，能夠?qū)⒋胖閺募?xì)胞上拆離，從而不會影響后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)、分化等過程。
[0022]

【具體實(shí)施方式】
[0023]下面將結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]一種細(xì)胞可逆分選載體，該載體包括特異性抗體、海藻酸鈉和磁珠，其中，海藻酸鈉包裹磁珠，抗體通過生物素-親和素系統(tǒng)與所述海藻酸鈉鏈接，并且，抗體還鏈接有待分選的細(xì)胞，從而形成了由“磁珠+海藻酸鈉+抗體+細(xì)胞”的復(fù)合結(jié)構(gòu)，另外，根據(jù)本【技術(shù)領(lǐng)域】的一般知識，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計等的需要，抗體也可以為二抗，也能實(shí)現(xiàn)到需要的效果。
[0025]進(jìn)一步，所述抗體偶聯(lián)b1tin (生物素)，所述海藻酸鈉偶聯(lián)SA (鏈霉親和素)，所述抗體與所述海藻酸鈉通過所述b1tin與所述SA之間的偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈接。
[0026]進(jìn)一步，該載體通過以下方法制備:
(一)海藻酸鈉包被磁珠
(I)海藻酸鈉配成10mg/ml溶液,合成1-1.2 μ m磁珠,配制10mM CaC12溶液(交聯(lián)劑)。
[0027](2) 10mg/ml海藻酸鈉與磁珠800ul:400ul (2:1)比例混合，室溫?fù)u床搖30min。
[0028](3)離心取上清液后，400ul雙蒸水重懸。
[0029](4)將重懸液滴入10mM的CaC12溶液，靜置1min (在Cacl2的交聯(lián)作用下，海藻酸鈉緊密包裹磁珠)。
[0030](5)磁性富集，400ul CaC12溶液重懸，靜置lOmin。
[0031](二)、海藻酸鈉偶聯(lián)SA (鏈霉親和素)。
[0032](I) Iml 的 10mg/ml 海藻酸鈉加 4.8mg EDC (碳二亞胺)和 13.2mg NHS (N-輕基琥拍酰亞胺)，室溫?fù)u床30min活化。
[0033]向活化的海藻酸鈉中加入10ul濃度為lmg/ml的SA溶液，振蕩器混勻4hour。
[0034](三)將抗體偶聯(lián)b1tin(生物素)
抗體標(biāo)記 b1tin 使用的是 Thermo 的 EZ-link NHS-b1tin reagents。
[0035]過程如下: A.1-1Omg蛋白或抗體溶于0.5-2.0mlPBS溶液
B.b1tin用DMSO或DMF配成1mM的溶液
C.將適當(dāng)體積的b1tin溶液與蛋白或抗體溶液混合
D.冰上孵育2小時或者室溫孵育30min
E.孵育后的溶液可直接使用或經(jīng)過分子篩柱純化后使用
(四)將SA與步驟(三)中的b1tin進(jìn)行偶聯(lián)
SA-海藻酸鈉標(biāo)記磁珠后SA上有4個b1tin的結(jié)合位點(diǎn)，這樣就可以結(jié)合4個標(biāo)記了b1tin的抗體，相對于抗體標(biāo)記的磁珠抓細(xì)胞更緊些，效果更好。
[0036]該細(xì)胞可逆分選載體在細(xì)胞分選中的應(yīng)用。
[0037]一種細(xì)胞可逆分選的方法，采用了上述細(xì)胞可逆分選載體。
[0038]進(jìn)一步，細(xì)胞可逆分選的方法，包括如下步驟:
1.離心收集待分離細(xì)胞，用少量PBE孵育液(0.5%BSA、0.08%EDTA, PH7.2 PBS，真空抽濾除菌及液體內(nèi)氣體)充分懸浮細(xì)胞(0.5mL / 1*108細(xì)胞)；
i1.加入偶聯(lián)有SA的被海藻酸鈉包被的超微磁珠，加入偶聯(lián)有b1tin的一抗(10?20 μ g/ml終濃度)，混勻后置4?15°C孵育20?30分鐘；
ii1.a)將分離柱安裝入磁場中，加入0.5mL PBE,在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱；
b)將孵育完畢的細(xì)胞懸浮液加到分離柱中，自然流盡；
c)以0.5mL PBE加入到分離柱中，自然流盡，洗柱一次；
d)從磁場中取下分離柱，插在試管口上，加入f2mLPBE，用針芯用力推盡液體，沖出陽性結(jié)合的細(xì)胞
iv.加入0.05?0.2mol/L的EDTA溶液2ml，在500(T8000rpm下離心10分鐘，棄去上清液，得到細(xì)胞沉淀，重復(fù)三次，得到陽性細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗一次；
通過以上步驟，最終得到去除了磁珠和海藻酸鈉的細(xì)胞，達(dá)到預(yù)期的效果。
[0039]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)胞可逆分選載體，其特征在于:所述載體包括特異性抗體、海藻酸鈉和磁珠，所述海藻酸鈉包裹所述磁珠，所述抗體通過生物素-親和素系統(tǒng)與所述海藻酸鈉鏈接，所述抗體表面還鏈接有待分選的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1中所述細(xì)胞可逆分選載體，其特征在于:所述抗體偶聯(lián)b1tin，所述海藻酸鈉偶聯(lián)SA，所述抗體與所述海藻酸鈉通過所述b1tin與所述SA之間的偶聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈接。
3.如權(quán)利要求1或2中所述細(xì)胞可逆分選載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 將海藻酸鈉包被磁珠； 將包被磁珠后的海藻酸鈉偶聯(lián)SA ； 將抗體偶聯(lián)b1tin ； 將SA與步驟(三)中的b1tin進(jìn)行偶聯(lián)。
4.如權(quán)利要求1或2中所述細(xì)胞可逆分選載體在細(xì)胞分選中的應(yīng)用。
5.一種細(xì)胞可逆分選的方法，其特征在于:采用了權(quán)利要求1或2中所述細(xì)胞可逆分選載體。
6.如權(quán)利要求5中細(xì)胞可逆分選的方法，其特征在于，包括如下步驟: 收集并充分懸浮待分離細(xì)胞； 將待分離細(xì)胞與可細(xì)胞逆分選載體特異性結(jié)合； 將步驟ii中得到的結(jié)合物放入到位于磁場中的分離柱中進(jìn)行初步分離，得到陽性結(jié)合的細(xì)胞； 加入EDTA進(jìn)行深度分離，實(shí)現(xiàn)海藻酸鈉與抗體分離，并得到表面鏈接抗體的細(xì)胞的拆分體，并分離和收集拆分體。
7.如權(quán)利要求6中所述細(xì)胞可逆分選的方法，其特征在于: 步驟i中包括以下過程:離心收集待分離細(xì)胞，用少量PBE孵育液充分懸浮細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求6中所述細(xì)胞可逆分選的方法，其特征在于: 步驟ii中包括以下過程:加入偶聯(lián)有SA的被海藻酸鈉包被的超微磁珠，加入偶聯(lián)有b1tin的一抗，混勻后置4?15°C孵育20?30分鐘。
9.如權(quán)利要求6中所述細(xì)胞可逆分選的方法，其特征在于: 步驟iii中，包括如下步驟: 將分離柱安裝入磁場中，加入0.5mL PBE，在重力作用下自然流盡，以預(yù)處理分離柱； 將孵育完畢的細(xì)胞懸浮液加到分離柱中，自然流盡； 以0.5mL PBE加入到分離柱中，自然流盡，洗柱一次； 從磁場中取下分離柱，插在試管口上，加入Γ2πι? PBE，用針芯用力推盡液體，沖出陽性結(jié)合的細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求6中所述細(xì)胞可逆分選的方法，其特征在于: 步驟iv中，包括以下過程:加入0.05?0.2mol/L的EDTA溶液2ml，在500(T8000rpm下離心10分鐘，棄去上清液，得到細(xì)胞沉淀，重復(fù)三次，得到陽性細(xì)胞，用培養(yǎng)基洗一次。
【文檔編號】C12N5/00GK104388378SQ201410749488
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】辛炳川, 孫萬祥, 周志波 申請人:江蘇三特生物科技有限公司