一種蜘蛛線粒體nd4基因全序列擴(kuò)增引物及鑒定方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蜘蛛的線粒體 ND4 基因全序列擴(kuò)增引物，并利用其全序列測(cè)序信息快速鑒定蜘蛛種類(lèi)的方法，包括蜘蛛基因組總DNA的提取， ND4 基因全序列擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增和測(cè)序，以及基于 ND4 堿基序列進(jìn)行蜘蛛種類(lèi)的快速鑒定。本發(fā)明可以快速、高效和特異地?cái)U(kuò)增多種蜘蛛的線粒體 ND4 基因的全序列，不僅能為蜘蛛種類(lèi)的快速鑒定，種群多樣性分析提供一個(gè)有力的工具，也能應(yīng)用于蜘蛛不同分類(lèi)階元系統(tǒng)進(jìn)化的分析研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種蜘蛛線粒體基因全序列擴(kuò)增引物及鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蜘蛛線粒體NADH還原酶復(fù)合體亞基4(NADH dehydrogenase subunits 4; ND4)基因的全序列擴(kuò)增引物及鑒定的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]蜘蛛是重要的害蟲(chóng)捕食性天敵，在有害生物綜合防治過(guò)程中具有重要的作用和地位。注意保護(hù)天敵種庫(kù)，促進(jìn)天敵群落重建，能有效的控制諸多農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，諸如飛虱、葉蟬、螟蟲(chóng)、棉蚜等的發(fā)生和危害?？焖俣鴾?zhǔn)確的物種鑒定是蜘蛛保護(hù)和利用的研究的必要前提和基礎(chǔ)。然而，基于外觀形態(tài)及解剖特征的傳統(tǒng)分類(lèi)鑒定方法不僅耗時(shí)耗力，而且對(duì)鑒定人員的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，常受主觀因素的干擾，極易混淆出錯(cuò)。另一方面，蜘蛛種類(lèi)繁多，對(duì)其開(kāi)展區(qū)系分類(lèi)研究也極為重要，這對(duì)蜘蛛種質(zhì)資源有效保護(hù)利用具有重要意義。
[0003]蜘蛛線粒體基因組由13個(gè)蛋白質(zhì)基因，22個(gè)tRNA基因，2個(gè)rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)共37個(gè)編碼基因及一段非編碼區(qū)(控制區(qū))組成，具有母系遺傳，拷貝數(shù)多，重組率低，進(jìn)化速度較快等優(yōu)點(diǎn)。其中線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I (COI)基因已作為公認(rèn)的分子標(biāo)記，應(yīng)用于蜘蛛等節(jié)肢動(dòng)物的群體遺傳學(xué)，系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及保護(hù)生物學(xué)等研究領(lǐng)域。
作為線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中7個(gè)編碼NADH還原酶復(fù)合體亞基的基因之一，進(jìn)化速率適中，亦可以應(yīng)用于蜘蛛種類(lèi)的快速鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化及分類(lèi)研究。然而擴(kuò)增線粒體癌因序列的通用引物鮮有報(bào)道，尤其是針對(duì)種類(lèi)繁多，具有重要利用價(jià)值的蜘蛛類(lèi)。因此，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增蜘蛛線粒體癌因全序列的通用引物，從而為高效獲得蜘蛛線粒體癌因全序列及其線粒體全基因組序列奠定基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蜘蛛線粒體ND4基因全序列擴(kuò)增引物及鑒定方法。
[0005]發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明首先提供了一對(duì)蜘蛛線粒體癌因全序列的通用擴(kuò)增引物，這對(duì)引物是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布的蜘蛛線粒體全基因組序列設(shè)計(jì)的，正向引物ND4-F如SEQ IDNO:1所示，反向引物ND4-R如SEQ ID NO:2所示:
SEQ ID NO:1: 5' -CCTAATCCATCTCAACCTA-3';
SEQ ID NO:2: 5' - TTCTAGTCTTAATAGTAT-3'。
[0006]利用上述一對(duì)蜘蛛線粒體ND4基因全序列擴(kuò)增引物，PCR擴(kuò)增測(cè)序后可實(shí)現(xiàn)對(duì)蜘蛛種類(lèi)的快速鑒定。具體包括以下步驟:
(I)采用DNA抽提試劑盒提取蜘蛛的總基因組DNA。為避免污染，舍去頭腹部，只從腿部提取DNA。
[0007](2)利用上述的一對(duì)引物，以抽提好的蜘蛛基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序(結(jié)果見(jiàn)圖1)。PCR反應(yīng)體系為50μ 1，其中:2μ I模板DNA (約20ng)，5 μ I 10XPCRbuffer, 4 μ I 2.5mM MgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.5 μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去離子水調(diào)至終體積50 μ I ;PCR反應(yīng)條件為:95° C預(yù)變性3分鐘，94° C變性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸I分鐘；35個(gè)循環(huán)后，72° C再延伸7分鐘。
[0008](3) PCR產(chǎn)物測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理分析，使用ClustalX軟件進(jìn)行DNA序列比對(duì)。達(dá)到物種鑒定的目的。
[0009]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的鑒定方法中，其中步驟(I)所述的蜘蛛種類(lèi)包括但不限于下述:擬水狼蛛{Pira ta subpira ticus)，三突花蛛{Ebrech tella tricuspida ta),橫紋金蛛(Arg1pe bruennichi)，維腹肖蛾(Jetragnatha maxi I 1sa)，華 _ 肖蛾{Tetragnatha,茶色新圓蛛(Afe1scofla iAeisi)、脈蝸蛛(fet/ic1sa venatrix) >黑色妮虎 iPlexippus ,大腹園蛛(Araneus Feflirico1SW1S)、貓?zhí)?iCarrhotusxantho gramma)。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:
1.本發(fā)明提供的蜘蛛線粒體ND4基因的序列擴(kuò)增引物，可以高效的擴(kuò)增多種蜘蛛的線粒體ND4基因的全序列，而不僅僅是部分序列，能應(yīng)用于蜘蛛不同分類(lèi)階元系統(tǒng)進(jìn)化和分類(lèi)研究；
2.本發(fā)明所述的通用引物及其設(shè)計(jì)方法可以作為通用引物PCR擴(kuò)增原理及關(guān)鍵參數(shù)研究的具體實(shí)例，促進(jìn)本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的發(fā)展，因而具備重要的發(fā)明價(jià)值和理論意義；
3.該方法所述的物種鑒定方法可以對(duì)多種蜘蛛進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，且不受發(fā)育階段和個(gè)體殘缺的限制，大大克服了形態(tài)鑒定的困難，縮短了鑒定的周期；該種蜘蛛的分子生物學(xué)鑒別方法對(duì)使用的儀器設(shè)備要求較低，且無(wú)需復(fù)雜的技術(shù)步驟和昂貴的試劑，一般的技術(shù)人員均可操作，比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別更準(zhǔn)確可靠。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明中蜘蛛線粒體ND4基因全序列擴(kuò)增引物用以擴(kuò)增不同種類(lèi)蜘蛛線粒體ND4基因全序列的電泳圖譜。
[0012]其中，M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(Mark IV) ; 1_10泳道依次為擬水狼蛛，三花突蛛，橫紋金蛛，錐腹肖蛾，華麗肖蛾，茶色新圓蛛、脈媧蛛、黑色蠅虎，大腹園蛛、貓?zhí)搿?br>
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)施例1:
(I)蜘蛛樣品的采集，鑒定及保存
實(shí)施例中所用蜘蛛種類(lèi)均用陷阱法采自浙江省余姚市農(nóng)田。所采標(biāo)本帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行信息登記，均用體視顯微鏡鑒定，以確定種類(lèi)，用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的蜘蛛標(biāo)本用100%的酒精浸泡并保存于4° C冰箱備用。所采集的蜘蛛種類(lèi)包括:擬水狼蛛，三花突蛛，橫紋金蛛，錐腹肖蛾，華麗肖蛾，茶色新圓蛛、脈媧蛛、黑色蠅虎，大腹園蛛、貓?zhí)搿?br> [0014]蜘蛛基因組總DNA的提取
采用DNA抽提試劑盒提取不同種類(lèi)蜘蛛的總基因組DNA。為避免污染，舍去頭腹部，只從腿部提取DNA。DNA直接利用DNA抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)提取。提取的總基因組-20° C保存?zhèn)溆谩?br> [0015]設(shè)計(jì)合成蜘蛛線粒體癌因全序列的擴(kuò)增引物
登陸NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收索已公布的蜘蛛全線粒體基因組序列，經(jīng)ClustalW軟件同源比對(duì),找出卿癌因上下游保守的序列,利用Premier primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出蜘蛛線粒體Μ)癌因全序列擴(kuò)增引物并送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。正向引物ND4-F如SEQ ID Ν0:1所示，反向引物ND4-R如SEQ ID Ν0:2所示:
SEQ ID NO:1: 5' -CCTAATCCATCTCAACCTA-3';
SEQ ID NO:2: 5' - TTCTAGTCTTAATAGTAT-3'。
[0016]PCR擴(kuò)增線粒體ND4基因全序列和序列測(cè)定
利用上述的一對(duì)引物，以抽提好的蜘蛛基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，PCR反應(yīng)體系為 50 μ 1，其中:2 μ I 模板 DNA (約 20ng)，5yl 10XPCR buffer, 4 μ I 2.5mMMgCl2, I μ I 10 mM dNTPs，各 I μ I 10 mM 正、反向引物，0.5 μ I 5U/μ I TaqDNA 聚合酶，加去離子水調(diào)至終體積50 μ I ;
PCR反應(yīng)條件為:95° C預(yù)變性3分鐘，94° C變性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸I分鐘；35個(gè)循環(huán)后，72° C再延伸7分鐘。
[0017]PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)(結(jié)果見(jiàn)圖1)，擴(kuò)增片段用凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)割膠回收。回收產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。
[0018]依據(jù)全序列信息快速確定蜘蛛的種類(lèi)。
[0019]對(duì)上一步測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理分析，用ClustalX軟件進(jìn)行序列信息比對(duì)，進(jìn)行物種鑒定。
[0020]通過(guò)引物測(cè)得蜘蛛的癌因全序列如下:
擬水狼蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:3所示:
ATAAAAATTATTTTACCAATAATCTCTTTAATCTTCTTTATAAATAACATTTCAATAATTATAATCTATTT
ATCAATTATAACAATTACAATATTATTTACTTATAATACAAAACATATAATAATTATAGATAATTCATTCATATTA
GATAAATTCTCTATAATCTTAATTTTATTAACCCTAATAAGAATCTTATTAATTATATTTTCTTCTCAAAATATAAA
TATAATCTCTAATATAATTATTCCAATTTTCATAATTTTAATATTAACTTTTTCAGTTATAAATATATTATCATTTT
ATATTCTATTTGAATTAGTATTAATTCCTACAATAATTTTAGTAATAAAATCAGGAAAACAACCTGAACGCTTACAA
GCCAGAATTTACTTAATATTATATACCATTACAGCTTCACTCCCTCTCTTAGTTAGTATTATTTTATTAAATTATAA
TCAATCATTCATTATATCATTCATAATAATAAATAAATTAAATATACCTTTACTATTTATATTAGCATTTTTAGCAA
AAATACCAATATTTTTCACTCATTTATGATTACCAAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCGTAGAAGGGTCAATAATTCTC
GCAGCAGTTTTATTAAAACTCGGCGGATATGGACTGATTCGATTTAGACCTCTTCTTTATGCCAAAACTATCCCATT
AAACTTCTGAATTTCTAGAATCAGTTTAATTGGAGCAATTATAACAAGAATAAATTGTATCCGACAAAAAGATTTAA
AATCTCTAATTGCTTACTCTTCAGTTGCCCATATAGGTCTAGTTCTAGCTAGAATTATAACCCTAAATTTCATCGGA
TTTTACGGAGCAATCTTAATAATAGTAGCCCATGGTCTATCCTCATCAGCCTTATTCCTAATAGTTAATATAATTTA
TACTAAACATCATACACGAAACATTATTTCATTTAAGGGTTTATGAAATTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGAT
TTGTCTTCATTGCAGCTAATATTTCCGCACCTCCTTCAATTAACTTAGCCGGAGAAATTTTTATTTTAATAAGTCTT
ATTAATTTAAATATTCTAATTCTAATCCCTTTTATTTTCATTTCATTAATAACTTCTATCTTTTCAATTACATTATTTTTAAACACAGTACATAACCAACCTAATTCTATTTTAGCTTCCTCTTCTTCTAATAAATTATATTTATGTTTATTCCTTCATTTATTTCCATTAATTGCAATTATTTCAAAACTTGATATCTCATTATTTTAA ；
三花突蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:4所示:
TTGCTAAAACTAGTTTTAATCTCTCTCTTTAATTTCCATTTAAATAATCATACTATAATCTTTATTTCATCTTTAATTATTTTATTTATTTTATTAAAAATAACAAACTTTAATATATATGCTTATGATAATTATTTTTTTAATGATAATATTTCATTAATACTAATTACTTTAACCTTAATAAGATTTCTATTAATCATTATAGTCACAGACTATTTTAATAAAATGATTAAAACAATAATACCTATTATAATCACTCTTTTACTAGTTTTTTCTACAAGAAATATGTTATTATTTTATATTATATTTGAAATTGTTTTAATTCCTACTATAATTTTAATTATATCATTAGGTAAACAACCAGAACGATTACAAGCTAGAATTTACCTAATAGTATATACAATTGTAGCATCTTTACCTTTACTTATAGTTATTATTTTAATAATATTTAATAAATCATTTATAACCAATTTAATCTTATTAAATAATATTAATATAATACTCCCAATTATTATTGCCTTTTTAGTAAAAAGACCTATGTTTTTATCTCATTTATGATTACCCAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCGTAGAAGGGTCAATAATTCTCGCAGCAGTTTTATTAAAACTCGGCGGATATGGACTGATTCGATTTAGACCTCTTCTTTATGCCAAAATTATCCCATTAAACTTCTGAATTTCTAGAATCAGTTTAATTGGAGCAATTATAACAAGAATAAATTGTATCCGACAAAAAGATTTAAAATCTCTAATTGCTTACTCTTCAGTTGCCCATATAGGTCTAGTTCTAGCTAGAATTATAACCCTAAATTTCATCGGATTTTACGGAGCAATCTTAATAATAGTAGCCCATGGTCTATCCTCATCAGCCTTATTCCTAATAGTTAATATAATTTATACTAAACATCATACACGAAACATTATTTCATTTAAGGGTTTATGAAATTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGATTTGTCTTCATTGCAGCTAATATTTCCGCACCTCCTTCAATTAACTTAGCCGGAGAAATTTTTATTTTAATAAGTCTTATTAATTTAAATATTCTAATTCTAATCCCTTTTATTTTCATTTCATTAATAACTTCTATCTTTTCAATTACATTATTTTTAAACACAGTACATAACCAACCTAATTCTATTTTAGCTTCCTCTTCTTCTAATAAATTATATTTATGTTTATTCCTTCATTTATTTCCATTAATTGCAATTATTTCAAAACTTGATATCTCATTATTTT ；
橫紋金蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:5所示:
ATAAAATTAGTCATCCCGATTATAACTTTAAGATTTTTATTTTTTAATTATGCTAATTATCTTATTATTTTATCATTCTCTATCCTTTTCATTTTTCTAAAACTTCCTTCCCTTCAAATATCAATTTTTAGAAAATTTATATTTAATGATTCAATCTCATTTATTATAATTTTACTTTCAATTATTAGAGTTATAATAATTATTATCTCTTCCTATACCTTAAAAAATTCTTTTGCTTTAACCACCTCCATTCTTTTAATTCTAATTTTAACCTTTTCTTCACTTAATATATTTTCATTTTATATACTATTTGAAATCGTTCTAATTCCAACATTATTTTTAGTAACCAAAATTGGTTATCAACCTGAACGCCTTCAAGCAGGTGTCTACTTAATAATTTACACAATTCTTGCCTCTTTACCCCTCTTATTAGGAATTTTATATTTTAAATATTCACCAAATTTTATTTTTCTTTCATCAAATTGTGAACAAATTAAAATTGCATTAATTTTTATTCTTGCTTTTTTAGTAAAAATACCCATATTTTTATTCCACCTTTGATTACCAAAAGCACACGTTGAAGCTCCCGTAGAAGGGTCAATAATTCTCGCAGCAGTTTTATTAAAACTCGGCGGATATGGACTGATTCGATTTAGACCTCTTCTTTATGCCAAAATTATTCCATTAAATTTTTGAATTTCTAGAATCAGTTTAATTGGAGCAATTATAACAAGAATAAATTGTATCCGACAAAAAGATTTAAAATCTCTAATTGCTTACTCTTCAGTTGCCCATATAGGTCTAGTTCTAGCTAGAATTATAACCCTAAATTTCATCGGATTTTACGGAGCAATCTTAATAATAGTAGCCCATGGTCTATCCTCATCAGCCTTATTCCTAATAGTTAATATAATTTATACTAAACATCATACACGAAACATTATTTCATTTAAGGGGCTATGAAATTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGATTTGTCTTCATTGCAGCTAATATTTCCGCACCTCCTTCAATTAATTTAGCCGGAGAAATTTTTATTTTAATAAGTCTTATTAATTTAAATATTCTAATTCTAATCCCTTTTATTTTCATTTCATTAATAACTTCTATCTTTTCAATTACATTATTTTTAAACACAGTACATAACCAACCTAATTCTATTTTAGCTTCCTCTTCTTCTAATAAATTATATTTATGTTTATTCCTTCATTTATTTCCATTAATTGTAATTATTTCAAAACTTGATATCTCATTAT ；
錐腹肖蛸卿癌因全序列如SEQ ID NO:6所示:
ATAAAAATTTTCTTATTATTCATGCCCCTATTAATATTTAATTCTAGATTTTATTTATTTTTATTATCTTCATCCATTTCTATATTATTTTATTTATTTTTTATTGTTAAAAATTTTAATACACAAATTACATCAAACTTAATAATAATAGACCCCTTATCAATATCCCTGACAATATTATCTTATTTAACTTTTATTATAATTTTTATATCCACAAATATAGATAAAGAAGCTAAATTATTATTATCTTTAATTTTAATTCTTTTAATTATTACATTTACACTGTCTAAGACAATAATATTTTATATTTTTTTTGAAATAATTTTAATCCCCACTCTCATTTTAATTACAAAAAAAGGTAACCAACCAGAACGCTTACAAGCAGGAATATATTTAATAATATATACTATTATTGCATCTCTTCCCCTCCTTCTTGCTATTTTATCTTATAAATCTTTAGAGTCCTTATTTTCTTCTTATCTTATAATTAAAAAAATTAATCTACCACTTATCTTTATACTAGCTTTTTTAGCCAAAACTCCTATATTTATAATTCACTTATGACTCCCTAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCTTAGAAGGGTCTATAGTTCTTGCTGCTATCCTTTTAAAATTAGGAGGATATGGTCTAATTCGATTTATCCCAATATCTCTACATTCCATAAAATCAATCCCACATTGAATTATTAGAATTAGAATAATAGGAGCAATTTTAACAAGATCAGGATGTATCCGTCAAAAAGATTTAAAAGCTTTAATTGCGTATTCATCTGTGGCCCACATGGCTGTCACCTTGTCAAGAATCATAATTTTTATAAAATCCTCTATAAATGGAGTAATCTTAATAATAATTGCTCACGGAATTTCATCCTCAGCTTTATTCTTTTTAGTTAATTTGACCTACAATAAATTTAATACCCGAAACACAATTAGATTGAAAAGAACCCAATTATCCCACCCTAATCTTACTTTCTGATGATTTATTTTTTCTATAATGAATATTAGAGCCCCACCCACCTTAAATCTAATAGGAGAGCTCCTTATATCAATAACCCTAATTAAATGACATATTATAAACGCCACAATTATTTTTATCATTACACTAATAACAACATCATTTTCTCTTTTAATTTTTCTAATACTTAATCATGGAAAATCTATAATAAAAATTTCTAAAAATGACCCAATAAAATTCTTTCTATCTTTAATAATCCACTTAGTTATATCAATTATAATCATTTTAAAAATAGAATTTATATTAATA ；
華麗肖蛸卿癌因全序列如SEQ ID NO:7所示:
TTGTCGAAAATTATAATAATAATAGTTTTTACTCTACTTACCAGAAATAGAATATATTTTTCTATAGCAATAATATCGTCTATTATAATTATAATCATAATTTTTTACAATAATATTTTAGATCTTCAAACATTAAATAGAATATTTATAATTGATTCCCTATCTTTAACTTTAATTCTCCTCTCTTCTATTACTTCTATTTTAATTATTATATCAACTAATATATTTTCATTTTCGAAAAAGATAATTATTATAATTTCATTAATTTTAATAATTACATTTTCAACATCCAAAACAATCATTTTTTATATTTTTTTTGAAATTGTCCTAATTCCTACAATAATTTTAATTACTAAAAGGGGAGCTCAACCCGAACGACTTAAAGCAAGAATATATCTTATTATATATACAATTTTAGCCTCTCTTCCCCTTCTTATTATTATTTTACTATGTAAATCTTGCGATGACTTCTTAAATGCCCCCATTACGATAAAAAAAATTGAAATTCCTCTATTATTTATAATAGCTTTTTTAGCTAAAACCCCAATGTTTATTATTCACATCTGACTTCCTAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCCTAGAGGGTTCAATAGTATTAGCAGCAGTCCTTCTTAAATTAGGAGGCTATGGAATAATTCGCTTTATTCCCCTATCCCTCTTCTCTTTAAAATTAATTCCCCATTGAATCTTAGCAATTAGAACAATGGGGGCGGTCTTCTCTAGAAGAGGGTGTTTACGTCAAAAAGATCTAAAAGCTTTAATTGCATATTCCTCAGTAGCTCATATAGCTATTACGTTGTCTAGAATCATAATTTTTTCTAAAACATCAATTAATGGGGCAATTATTATAATAATTGCCCACGGACTCTCCTCTTCAGCTTTATTTTTTTTAGTAAACTTAACCTATACTAAATTTCACACTCGAAATATAATTTCACTTAAAAGAATATTTTCTTCCAACCCTAACACAACATTTTGATGATTAATATTTTGCATAGCAAATATTAGAGCACCCCCATCTCTTAATTTAATTGGGGAATTATTAATATCTATAGCATTAATTAAGTGAAACATAATTTTATCCGTATTCATTATTATTATTACCCTATTAACTACCTCCTTTTGTGTTATTATATTCTTAATATTAAATCATGGCTCATCTATACTTAAAATTTCTAATAATGATTCTATAAAATTTTATATATCCCTATTTATTCACTTATTTATTTTAATTATAATTATCCTAAAAATAGAATTTATATTAGTG ；
茶色新圓蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:8所示:
ATAAAAATTATTTTTCCTTTAATAACAATAAGATTCTTTTTATTTAATTATATAAATTTTATAATTTTAAT
ATCAATTTCATCTTTTATTTTACTTTTAAAATTTTACTCTTTTAAACTATCTATTTTTAATAAATTTATATTTATA
GATCATCTTTCATTAATTATAATTTTATTATCATTTTTAAGAGTAATAATAATTATTATATCCTCTTATACATTAAAAAATTCTTATTTATTCATTTCATCAATTTTATTGATTCTTATTCTTACATTTTCTTCTAGAAATATATTTTCATTTTATATATTATTTGAACTAGTATTAATTCCCACATTACTTCTTATTACTAAAATTGGATATCAACCAGAACGATTACAGGCCGGGATTTACCTAATAATTTATACAATTATTGCATCACTCCCCCTTCTTCTAGGTATCCTATATTTTAAATATACTCCTAATTTCATTATTTTAAGATCAAACTGCGAACAAACTAAAACTATAATTATTTTTATTTTAGCCTTTTTAGTAAAAATGCCAATATTTTTATTTCATCTTTGATTACCTAAAGCACATGTAGAAGCCCCAGTAGAAGGATCAATAATTTTAGCTGCTGTTTTATTAAAATTAGGAGGATACGGATTAATTCGATTCTCACCTTTATTATATTCAAAATTTATTCCAATAAACTTTTGAATTTCAAGAATTAGTTTAATTGGAGCCATTATAACTAGAATAAATTGTATTCGACAAAAAGACTTAAAATCCTTAATTGCTTACTCTTCCGTCGCGCATATAGGATTAGTATTAGCAAGAATTATAACATTTAACTCAATTGGATTTTATGGAGCAATCTTAATAATATTTGCACATGGTATCTCTTCATCCGCCCTTTTCCTAATAGTTAATATAATTTATACAAAACACCACACCCGAAATATTATTTCTTTTAAGGGATTATGAAATTCATTTCCTAATATTACATTCTGATGATTTATTTTCATTGCAGCTAATATCTCTGCACCCCCATCTATTAATCTAGCAGGAGAAATCTTTATTCTTACAAGCCTAATCAACTTTAATATTTTAATTTTAATTCCATTCATTTTTATCTCACTAATAACTTCAATCTTTTCAATTTCATTATTTTTAAATACTTCACATAATCAAACTAATTCTAGGCTAGCATTAAACTCCTTTAATAAATTATATTTATGTTTATTTGCTCATCTTATTCCATTAGTCTTAATAATTTCAAAAATAGAAATATTCATAATATAA ；
脈媧蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO:9所示:
TTGATAAAAATTACCCTACCACTTATATATTCATTATTATTAATAAATAATAACATTTCAACTATTATTATATTTTTATCTTGCATAATAATTACAATTCTACTTATTTTTAATCCAAAACACACTATTATTATTAGAAACACATTTATAATAGACAAATTTTCTATAATTTTAATTTTATTAACTCTAACAAGAATCCTACTAATTATATTCTCCTCTCAAAACATAAAAACAATTTCAAAAACAATTATTCCAATCTTCATTATTTTAATACTAACTTTCTCAGTTATAAGTATAATATTATTTTATATTTTATTTGAATTAGTATTAATTCCAACTATAATTTTAGTAATAAAATCAGGAAAACAACCTGAACGTCTACAAGCTAGAATTTATTTAATAGTATACACCATTACAGCCTCATTACCTTTATTAGTCAGAATCATTCTATTAAATTATAATCAATCTTTCATTATATCTTTTATAACAATAAACAAATTAAACATACCTATTCTATTTATATTGGCATTTTTAACAAAAATACCTATATTCTTTATACATCTTTGACTTCCCAAAGCTCATGTAGAAGCTCCCCTAGAAGGTTCAATAATTCTAGCAGCTATTTTATTAAAACTAGGAGGATATGGTTTAATACGATTTATTCCCTTATGTATTTCCAAAATTAATAAAATCAACCATTGAATTATTAGAATTAGAATAATTGGTGCAACATGTACAAGACTTAACTGTATTCGACAAAAAGATTTAAAATCCTTAATTGCCTATTCATCAGTAGCTCATATAGCTCTAGTCTTACTAAGTATATTTACATTAAATTACATCGGATTAATAGGAGCTGTAATAATAATAATTGCCCATGGACTATCCTCATCCGCTTTATTCCTCCTAACAAATGACTTATACTCCAAATATCATACTCGTAACATCTCCTCCTTTAAAGGATTAATTAATTTATCTCCTAACATTACATTCTGATGATTTATATTTATAGCTATTAGTATCTCTGCTCCTCCATCAATTAATACAATTAGAGAAATTATAATTATATCAAGAATCATTTTATGAAATATGAAATCAATACTTTTAATTTTTATTATTTCCATCATAACTACCTCATTCTCAATAATAATATACTTAAACTTATCTCATAATAAAAATGAAATATTACCATCTAATCAATCATCAATAAAACTATTTACATCTTTATTCATTCATATAATTCCTTTAATCTTAATTCTATTCAAAATGGATTTAATAATTCTATATTCTATCTAG ；
黑色蠅虎卿癌因全序列如SEQ ID NO: 10所示:
ATAAAAATTGTACTCCCATCTTCATCTGTCATCATATTAATACTTATAAAATTTAATATTCTACCTTTATA
CATAATAATTATAATTCCTATCATTCTCACAATAATTTTAACTCTTAACATCAAATTTTCATTAATATCTATCTTA
TATATAATAGATCCTTTATCAATTATTATAATTCTACTAACTTTAATGAGAACTTTATTAATTTACCTCTCCTCATA
TAATCTAAAATATATTACTCCCACTATATCTTTAATTATAATTACATTGCTAATAACTTTTTTTTCAAAAAATATAT
TAATATTCTATATTATATTTGAGCTAGTATTAATTCCCACTATAATCTTAATTACCATAAATGGTAAACAACCAGAA
CGTCTTCAAGCCAGAATCTATTTAATTATTTATACAGTAACAGCTTCACTTCCACTACTAATAACAATTATTTTCACTCACTATAACAACTCATTTATATTTAGAAGAATTTCTATACTAAAATTTTCCATAGTAATCTTTATTATAATAGCCTTTCTAGTTAAAATACCTATATACTTAACACATTTATGATTACCAAAAGCTCATGTAGAAGCCCCTCTAGAGGGATCCATAATCCTAGCAGCTGTCTTATTAAAGCTAGGAGGATATGGAATTATTCGATTCATACCTTTATGTATTTCCACTATTAACAAAATTAACTTTTGAATTATTAGAATTAGATTAATCGGAGCTACCGCTACTAGAATAAATTGTATTCGACAAAAAGATTTAAAATCACTAATCGCTTATTCCTCTGTTGCCCATATAGGATTTGTTCTTACAGGATTATTTACATTAAACTATATCGGATTAATAGGATCAATTACAATAATAATCGCTCACGGACTAGCCTCCTCAGCTTTATTCTTATTAGTAAATGATTTATACTATAAATATCACTCTCGAAATATCTTAATATTTAAAGGACTATTAACACTAATACCTAATATTACCTTTTGATGATTTATATTTATAGCATTAAATATTTCCGCTCCTCCTACTATTAATACCTTAAGAGAAATTATAATAATATCAAGATTAATTTACTGAAATAATAATTCAATTATCATAATTTTCATAATATCCTTAATAACAGCTTCTTTCTCTTTAATAATATTTGTAAATATTATCCATAATAAAAATAATATATTACCTTCAATTAATACACCCCAAAAAATTTTTCTATCTTTATTTCTCCATTTTATTCCAACAGTAATAATAATTATAAAATTAGAAATAATCTCTTCCTAA ；
大腹園蛛卿癌因全序列如SEQ ID NO: 11所示:
ATAAAACTTGTAATCCCTTTATTGACTATAAGATTCCTAATATTTAATTATTCAAATTTTTTAATTATTATATGTGTCTTAACAATATTTTTATTAACAAAATTTCATTCTTTTCAAATAATTATTTTTAATAAATTTATATTTACAGACTATATTTCTTTAATTATAATTATATTATCAATTATTAGAGTTATAATAATTATTATTTCTTCCTCTACACTAAATTATTCATTTTTACTCATTACATCTATTTTACTTACACTTATTCTTACTTTTTCATCTTTGAATATATTTTCCTTTTATATATTATTTGAAATTGTATTAATTCCAACATTACTTCTTATTACCAAAATCGGGTACCAGCCCGAACGACTTCAAGCTGGAATTTACTTAATAATTTATACTATCATTGCATCTCTTCCACTACTCTTAGGAATCTTATATTTCAAGTCCACACCCAATTTTATTTTCATTACCTCAACATGTGAACAAATTAAAATTACAATTATCTTTATTTTAGCTTTCCTAGTAAAAATACCAATATTTTTATTTCATTTATGATTACCTAAAGCTCATGTAGAAGCTCCAGTAGAAGGGTCAATAATTCTAGCCGCCGTTCTTTTAAAGCTTGGCGGTTACGGATTAATTCGATTTAGTCCCCTTTTATATTCAAAATTAATTCCCTTAAACTTTTGAATTTCAAGAATCAGATTAATTGGGGCAATTATAACAAGAATGAATTGTATTCGCCAAAAAGACCTTAAATCTCTTATTGCATATTCTTCTGTAGCCCATATAGGACTTGTCTTAGCAAGAATTACAACATTAAATTACATTGGGGTATATGGTGCTATCTTAATAATAGTAGCTCACGGATTATCATCCTCGGCTCTTTTTTTAATAGTAAATATAATTTATACAAAACATCATACTCGAAATATTATTTCGTTTAAGGGGTTATGAAGTTCTTTTCCTAATATTACTTTTTGATGATTCATCTTTATCGCAGCCAATATCTCCGCACCCCCTTCTATTAACTTAGCAGGAGAAATCTTTATTTTAGTTAGATTAATTAATTGAAACTACTTCATTTTAATTCCATTTATTTTTATCTCTATTATAACTTCTATTTTTTCAATTTCATTATTTCTTAATACTACTCATAATCAGTCAAATTCCAAATTTGCAATATATTCTCATAATAAATTATACTTATGTTTATTTCTCCATCTATTCCCTCTCATCTTAGTTATTACTAAATTAGAACTAATTATATTTTAA ；
貓?zhí)肭浒┮蛉蛄腥鏢EQ ID NO: 12所示:
ATGTTAAATATATCCTTTACTTTAATATTTCCGCTATATATAATTATTAAACTCAACTCTACCTCCACATT
TATTATCATTATAACTTTACTAACCCTATTATTTTTAATAAAATTCAATAATAAATTTCCCATTATATCTCAATTC
CTATTACTAGACCACACCTCATTAATTATATTAATATTAACAACTACCAGAATTCTACTAATTATCCTTTCCACCTC
TCACTTATTATTAATTTCTAAAACAATCATCCCTATTCTAATTATTCTAATCATAACCTTTATATCAGATAATATTA
TTATATTTTATATTTTATTTGAAATAGTATTAATTCCAACAATATTTTTAATCACATTAAATGGTAAACAACCCGAA
CGACTCCAAGCTAGTATTTACTTAATCATTTATACAGTAACAGCTTCACTTCCTCTATTAATTAGTATTATTTGAAT
AAAATATAACTCTTCTTTCCTCTTTAATATTACATTATCATCTAAATTTTCAATAATTATCTTTATAATAATAGCCT
TTCTAGTTAAAATGCCTATATATTTAACACACCTATGACTACCAAAAGCTCATGTAGAAGCTCCTTTAGAAGGATCA
ATAATTTTAGCCGCTGTATTATTAAAATTAGGAGGATATGGTATCATTCGATTTTTACCATTATGCATTTCATCAAT



UL
oXVX3X3V3X0XX33V0VX3VVVVXVXXVVXXVXXXXVX3XX33XXV3XXXV3XXVVXXVXX33
XV3VXXXXXVVVVV3VXV3X3V0V3VXXX3XXX0XVXVXXVV0XVVVVV3VV3V3XXVXXVXVVVX0XXXVXVVX3V
XXX3X3XXX3X330X3VVXVVXXX3XVXVVX3XXXXXVVXXV0V30VV3XX0VVXVV0VV0X33X3XVXXVX0VX3X
VXVVXVVXVXXVVV0V0VVXV33VXVVXXVX3VX33X33X30V3XXXVXVVVXXV30VXVXXXVXV3XXV0XV0X3X
X33VVX0XVVX33VXVX3VV3VVXVVXXV00VVVXXXVXXXXVXXVXVVV0333VXV3XVXVVVVXV3VXVXXVV03
VVVX0VXXX333XXXX3330V3XX3XV3XVXXV003V3X30XXVVXVVXVXXVVXVXX0000VVV3XX000XXVV3X
XVV3XXX3VXXX0X3X0VV3VVX3VX03XXV00VXV3V3X30VX0V3XX3XXVXX30XXVVX3X3XVVVVX3XV0VV
【權(quán)利要求】
1.一種蜘蛛線粒體ND4基因全序列擴(kuò)增引物，其特征在于:正向引物ND4-F如SEQID NO:1所示，反向引物ND4-R如SEQ ID NO:2所示，
SEQ ID NO:1: 5' -CCTAATCCATCTCAACCTA-3';
SEQ ID NO:2: 5' - TTCTAGTCTTAATAGTAT-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增引物，其特征在于，所述擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法為:登陸NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已測(cè)定的蜘蛛線粒體全基因組序列，經(jīng)ClustalX同源比對(duì),在ND4基因上下游找出保守的序列,利用Premier primer 5.0軟件設(shè)計(jì)出蜘蛛線粒體ND4基因全序列擴(kuò)增引物。
3.一種基于如權(quán)利要求1所述擴(kuò)增引物的蜘蛛種類(lèi)鑒定方法，其特征在于該方法按以下述步驟進(jìn)行:(I) DNA抽提試劑盒法提取蜘蛛的總DNA; (2)設(shè)計(jì)蜘蛛線粒體癌因全序列的擴(kuò)增引物；(3)以蜘蛛總基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒法割膠回收廣增片段，測(cè)序；依據(jù)全序列信息快速確定蜘蛛的種類(lèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中為避免蜘蛛腸道內(nèi)容物的污染，舍去頭腹部，只從其腿部提取DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中蜘蛛種類(lèi)包括:擬水狼蛛，三突花蛛，橫紋金蛛，錐腹肖蛾，華麗肖蛾，茶色新圓蛛，脈媧蛛，黑色蠅虎，大腹園蛛，貓?zhí)搿?br> 6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)的擴(kuò)增引物為:正向引物ND4-F如SEQ NO:1所示，反向引物ND4-R如SEQ NO: 2所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟⑶的PCR反應(yīng)體系為50μ 1，其中:2μ I 模板 DNA，5yl 10XPCR buffer, 4μ I 2.5 mM MgCl2,1 μ I 10 mMdNTPs，各Ιμ? 10 mM正、反向引物，0.5μ I 5U/μ I TaqDNA聚合酶，加去離子水調(diào)至終體積50μ I ;PCR反應(yīng)條件如下:95° C預(yù)變性5分鐘，94° C變性30秒，50° C退火40秒，72° C延伸I分鐘；35個(gè)循環(huán)后，72° C再延伸7分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中凝膠電泳采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)全基因序列堿基信息進(jìn)行蜘蛛種類(lèi)鑒定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450698SQ201410753746
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月11日
【發(fā)明者】俞曉平, 王正亮, 李超 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院