一種利用染色體特異位點(diǎn)在單細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用染色體特異位點(diǎn)在單細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)的方法，包括以下步驟：a)初篩待檢測(cè)染色體的特異位點(diǎn)；b)選取健康人群的單細(xì)胞樣本；c)利用全基因組隨機(jī)引物對(duì)單細(xì)胞樣本進(jìn)行等溫置換擴(kuò)增；d)將單細(xì)胞擴(kuò)增后的樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并進(jìn)行高通量測(cè)序；e)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)不同人同一特異位點(diǎn)上獲得的數(shù)據(jù)量，篩選數(shù)據(jù)量比較均一的特異位點(diǎn)；f)利用篩選出的特異位點(diǎn)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)。本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)針對(duì)整個(gè)基因組的所有染色體進(jìn)行高通量測(cè)序需要測(cè)量大量無(wú)關(guān)數(shù)據(jù)的缺陷，可顯著的提高檢測(cè)的通量，從而降低檢測(cè)成本，快速簡(jiǎn)便，有助于染色體非整倍體檢測(cè)的大規(guī)模推廣。
【專利說(shuō)明】一種利用染色體特異位點(diǎn)在單細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體 非整倍體檢測(cè)的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種利用染色體特異位點(diǎn)在單細(xì)胞擴(kuò) 增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 不孕不育是遍及全球的生殖健康問題，近年來(lái)不孕癥患者呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。1995 年世界衛(wèi)生組織人類生殖特別規(guī)劃署的統(tǒng)計(jì)顯示，全球不孕夫婦已達(dá)6000-8000萬(wàn)對(duì)，中 國(guó)不孕夫婦約1200-1500萬(wàn)對(duì)，占育齡人群中的15-20%。輔助生殖技術(shù)已成為目前治療不 孕不育的主要手段。
[0003] 然而，根據(jù)國(guó)際權(quán)威統(tǒng)計(jì)，試管嬰兒手術(shù)的平均成功率只有30%左右，如何提高試 管嬰兒的成功率是當(dāng)前急需解決的難題。而通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，試管嬰兒失敗絕大部分歸因于 植入胚胎本身的問題。現(xiàn)代社會(huì)，隨著工作壓力的不斷增加，越來(lái)越多的女性推遲生育年 齡，在不孕癥夫婦中，高齡婦女占20% -30%，經(jīng)輔助生殖治療后成功率只有20 %左右，而 年輕的婦女成功率可達(dá)40% -50%。主要原因在于隨著年齡的增加卵母細(xì)胞的質(zhì)量明顯下 降，卵母細(xì)胞非整倍體率明顯增加。由于植入的成功率低，很多婦女要承受反復(fù)著床失敗的 痛苦。
[0004] 為了提高試管嬰兒的成功率，臨床上針對(duì)一些高齡、反復(fù)種植失敗、習(xí)慣性流產(chǎn)的 人群進(jìn)行胚胎植入前的檢測(cè)，在胚胎植入母體之前，對(duì)其遺傳物質(zhì)進(jìn)行分析，選擇遺傳背景 正常的胚胎植入，提高妊娠成功率，避免缺陷患兒的出生，減輕家庭和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0005] 目前臨床上常用的胚胎植入前檢測(cè)技術(shù)是熒光原位雜交（FISH)、比較基因組雜交 (CGH)。然而這兩種技術(shù)都存在一定的局限，F(xiàn)ISH技術(shù)目前存在的問題在于無(wú)法一次性檢測(cè) 所有染色體，操作繁瑣，分辨率低；CGH的缺點(diǎn)在于只能檢測(cè)已知的染色體異常，并且費(fèi)用 昂貴。近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，很多研究機(jī)構(gòu)開始將二代測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于胚胎植 入前的檢測(cè)，經(jīng)驗(yàn)證，其準(zhǔn)確度和檢測(cè)通量方面均優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)。目前通過(guò)二代測(cè)序進(jìn)行胚 胎植入前檢測(cè)的常規(guī)操作，首先是要分離胚胎的少量細(xì)胞，對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增， 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。操作步驟較多，耗時(shí)較長(zhǎng)，易出現(xiàn)操作錯(cuò)誤，而且要經(jīng)過(guò)多次擴(kuò)增， 其引入的一些擴(kuò)增偏好性和擴(kuò)增錯(cuò)誤也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。因此臨床上需要開發(fā)一 種更簡(jiǎn)單快速且成本低廉的檢測(cè)技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種非治療目的的利用染色體特異 位點(diǎn)在單細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)的方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0008] -種非治療目的的利用染色體特異位點(diǎn)在單細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體非整倍 體檢測(cè)的方法，包括以下步驟：
[0009] a)根據(jù)已經(jīng)公布的人類基因組序列，從待檢測(cè)的染色體上篩選得到初篩特異位 占.
[0010] b)選取健康人群的單細(xì)胞樣本；
[0011] C)利用全基因組隨機(jī)引物對(duì)所述的單細(xì)胞樣本進(jìn)行等溫置換擴(kuò)增；
[0012] d)根據(jù)初篩特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，將單細(xì)胞擴(kuò)增后的樣本利用所述的引物進(jìn)行文庫(kù) 構(gòu)建并進(jìn)行高通量測(cè)序；
[0013] e)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)不同人同一特異位點(diǎn)上獲得的數(shù)據(jù)量，選擇出 數(shù)據(jù)量比較均一的特異位點(diǎn)，得到復(fù)篩特異位點(diǎn)；
[0014] f)對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)：對(duì)待測(cè)樣本的單細(xì)胞進(jìn)行等溫置換擴(kuò) 增；將單細(xì)胞擴(kuò)增后的樣本利用復(fù)篩特異位點(diǎn)的引物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并進(jìn)行高通量測(cè)序；根 據(jù)不同染色體上各位點(diǎn)的reads數(shù)差異判斷待測(cè)樣本的染色體非整倍性。
[0015] 步驟a)中，所述的初篩特異位點(diǎn)符合以下標(biāo)準(zhǔn)：
[0016] a)序列長(zhǎng)度的范圍為150-200bp ;
[0017] b) GC含量在45 %?55 %之間；
[0018] c)序列中不包含字符"N"；
[0019] d)與單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)庫(kù)進(jìn)行比較，序列中不存在任何單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)；
[0020] e)與基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)中拷貝數(shù)變異信息進(jìn)行比較，所述的初篩特異位點(diǎn)不能包 含在任何已知的拷貝數(shù)變異中；
[0021] f)兩初篩特異位點(diǎn)片段間不能有超過(guò)l〇bp的同源序列，且Tm值相差在4度以內(nèi)。
[0022] 步驟b)中，所述的單細(xì)胞樣本是口腔上皮細(xì)胞的單細(xì)胞樣本。
[0023] 步驟b)中，所述的單細(xì)胞樣本的數(shù)目大于或等于100個(gè)。
[0024] 所述的復(fù)篩特異位點(diǎn)在所有單細(xì)胞樣本中的標(biāo)準(zhǔn)方差< 20。
[0025] 步驟f)中，統(tǒng)計(jì)不同染色體上各復(fù)篩特異位點(diǎn)的reads數(shù)時(shí)，通過(guò)值平滑算法對(duì) 每個(gè)復(fù)篩特異位點(diǎn)的片段數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后根據(jù)如下公式計(jì)算待測(cè)樣本的其中一條待 測(cè)染色體值：

【權(quán)利要求】
1. 一種非治療目的的利用染色體特異位點(diǎn)在單細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體非整倍體 檢測(cè)的方法，其特征在于，包括以下步驟： a) 根據(jù)已經(jīng)公布的人類基因組序列，從待檢測(cè)的染色體上篩選得到初篩特異位點(diǎn)； b) 選取健康人群的單細(xì)胞樣本； c) 利用全基因組隨機(jī)引物對(duì)所述的單細(xì)胞樣本進(jìn)行等溫置換擴(kuò)增； d) 根據(jù)初篩特異位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，將單細(xì)胞擴(kuò)增后的樣本利用所述的引物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建 并進(jìn)行高通量測(cè)序； e) 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)不同人同一特異位點(diǎn)上獲得的數(shù)據(jù)量，選擇出數(shù)據(jù) 量比較均一的特異位點(diǎn)，得到復(fù)篩特異位點(diǎn)； f) 對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行染色體非整倍體檢測(cè)：對(duì)待測(cè)樣本的單細(xì)胞進(jìn)行等溫置換擴(kuò)增；將 單細(xì)胞擴(kuò)增后的樣本利用復(fù)篩特異位點(diǎn)的引物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并進(jìn)行高通量測(cè)序；根據(jù)不同 染色體上各位點(diǎn)的reads數(shù)差異判斷待測(cè)樣本的染色體非整倍性。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a)中，所述的初篩特異位點(diǎn)符合以下 標(biāo)準(zhǔn)： a) 序列長(zhǎng)度的范圍為150-200bp; b) GC含量在45%?55%之間； c) 序列中不包含字符"N"； d) 與單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)庫(kù)進(jìn)行比較，序列中不存在任何單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)； e) 與基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)中拷貝數(shù)變異信息進(jìn)行比較，所述的初篩特異位點(diǎn)不能包含在 任何已知的拷貝數(shù)變異中； f) 兩初篩特異位點(diǎn)片段間不能有超過(guò)IObp的同源序列，且Tm值相差在4度以內(nèi)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中，所述的單細(xì)胞樣本是口腔上皮 細(xì)胞的單細(xì)胞樣本。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b)中，所述的單細(xì)胞樣本的數(shù)目大于 或等于100個(gè)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的復(fù)篩特異位點(diǎn)在所有單細(xì)胞樣本 中的標(biāo)準(zhǔn)方差< 20。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟f)中，統(tǒng)計(jì)不同染色體上各復(fù)篩特異 位點(diǎn)的reads數(shù)時(shí)，通過(guò)值平滑算法對(duì)每個(gè)復(fù)篩特異位點(diǎn)的片段數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后根 據(jù)如下公式計(jì)算待測(cè)樣本的其中一條待測(cè)染色體值：
其中，Py其中一條待測(cè)染色體上復(fù)篩特異位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化后的平均片段數(shù)量除以所有 待測(cè)染色體上復(fù)篩特異位點(diǎn)總和的標(biāo)準(zhǔn)化后的平均片段數(shù)量； Po:-個(gè)測(cè)序泳道中所有樣本h的中值； Iij :各條待測(cè)染色體上復(fù)篩特異位點(diǎn)平均片段數(shù)量的總和； Zj:樣本j的其中一條待測(cè)染色體值。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的平均片段數(shù)量是按照20%切尾均 值方法計(jì)算，即去除掉10%的最低值以及10%的最高值。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450922SQ201410770910
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】梁波, 孔令印, 冒艷, 宣黎明, 申靜靜, 祝軼君 申請(qǐng)人:賽業(yè)健康研究中心（太倉(cāng)）有限公司