一種等滲透壓平衡培養(yǎng)液的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于有關(guān)水產(chǎn)生物的染色體工程領(lǐng)域。本發(fā)明是一種用于低倍鯽魚染色體誘導(dǎo)加倍成高倍鯽魚品種過程中的等滲透壓平衡培養(yǎng)液，由以下組分構(gòu)成：硝酸鈣90-100mg/L，無水硫酸鎂50-60mg/L，無水磷酸二氫鈉650-700mg/L，氯化鉀400-450mg/L，氯化鈉8000-8500mg/L，葡萄糖6000-6500mg/L，余量為水。將本發(fā)明用于低倍鯽魚染色體加倍的誘導(dǎo)過程中，可成功誘導(dǎo)出高倍體鯽魚，并可有效地減少由于受精卵內(nèi)外滲透壓差而損失的高倍體細(xì)胞數(shù)量，繼而使得誘導(dǎo)后受精卵成活率大幅提升。
【專利說明】一種等滲透壓平衡培養(yǎng)液

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域中有關(guān)水產(chǎn)生物的染色體工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于鯽魚染色體加倍的等滲透壓平衡培養(yǎng)液。

【背景技術(shù)】
[0002]在動(dòng)物育種中，特別是魚類的育種中，通常采用種類不同遺傳背景種群雜交、染色體加倍、系統(tǒng)選育這幾種途徑來提高其生長優(yōu)勢、抗病性等生產(chǎn)性狀。其中，創(chuàng)造高倍體是這些途徑中最為有效的一種改善其生長優(yōu)勢的途徑。比如在自然界中，如鯽魚這樣的魚類通常存在有二倍體、三倍體以及少量的四倍體這三種倍性類型，已有研宄表明鯽魚倍性越高，生長優(yōu)勢則越為明顯。
[0003]創(chuàng)造高倍體個(gè)體的方法通常采用壓力變化、溫度變化、激素變化等。其中誘導(dǎo)染色體加倍的方法是最普遍和最成熟的創(chuàng)造高倍體的主要方法。這種方法通常在動(dòng)物發(fā)育過程中，當(dāng)受精卵發(fā)育到單細(xì)胞期后，要進(jìn)行第一次卵裂，形成兩個(gè)細(xì)胞，此時(shí)組織細(xì)胞分裂，則細(xì)胞內(nèi)通過有絲分裂形成的加倍染色體。在此時(shí)單細(xì)胞分裂受到短暫抑制，形成的雙倍倍數(shù)的染色體不能分離到兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)，則強(qiáng)行融合，形成具有加倍染色體的單細(xì)胞。經(jīng)過抑制分裂的單細(xì)胞再次進(jìn)行卵裂，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目均為加倍的倍數(shù)。因此，從原理上來說，二倍體動(dòng)物形成四倍體動(dòng)物、三倍體形成六倍體、或者四倍體形成八倍體是可行的。
[0004]而在現(xiàn)階段的動(dòng)物育種研宄中，二倍體到四倍體的動(dòng)物染色體已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)，但從四倍體加倍到八倍體，這種可以創(chuàng)造更具有生長優(yōu)勢生物品種的誘導(dǎo)方式，至今還沒有出現(xiàn)行之有效的解決方法。導(dǎo)致這個(gè)問題主要有兩方面的原因，其一是染色體數(shù)量越多，在染色體加倍的過程中，染色體越容易錯(cuò)配、丟失，造成后代的染色體紊亂，從而導(dǎo)致多數(shù)染色體加倍后胚胎不能發(fā)育；其二是經(jīng)過熱處理后的卵，細(xì)胞膜組織軟化，造成細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)外滲透壓的不一致而外滲，胚胎發(fā)育所需營養(yǎng)缺失，導(dǎo)致加倍后的胚胎無充足營養(yǎng)而死亡。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于鯽魚染色體加倍的等滲透壓平衡培養(yǎng)液，這種等滲透壓平衡培養(yǎng)液可調(diào)節(jié)受精卵內(nèi)外的滲透壓，有效地提高了高倍體受精卵的成活率以及染色體加倍的成功率。
[0006]本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案:
[0007]一種等滲透壓平衡培養(yǎng)液，特征在于該培養(yǎng)液用于鯽魚染色體加倍的誘導(dǎo)過程中，培養(yǎng)液由以下組分構(gòu)成:硝酸I? 90-100mg/L，無水硫酸鎂50-60mg/L，無水磷酸二氫鈉650-700mg/L,氯化鉀 400_450mg/L，氯化鈉 8000_8500mg/L，葡萄糖 6000_6500mg/L，余量為水。使用這種等滲透壓平衡培養(yǎng)液來誘導(dǎo)鯽魚染色體的加倍，能夠有效地降低在胚胎培養(yǎng)過程中由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差而損失的高倍體細(xì)胞數(shù)量，繼而使得誘導(dǎo)加倍后受精卵的成活率得到提升，染色體加倍的成功率也得到了大幅提升。
[0008]這種等滲透壓平衡培養(yǎng)液，可以用于魚類染色體從四倍體加倍到八倍體的誘導(dǎo)過程中，可以通過平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，避免造成八倍體細(xì)胞不必要的損失，提高染色體加倍的成功率，繼而創(chuàng)造出至今還尚未被報(bào)道的八倍體鯽魚。同時(shí)，這種等滲透壓平衡培養(yǎng)液也可能可用于其他魚類染色體加倍的誘導(dǎo)操作中，來實(shí)現(xiàn)平衡受精卵內(nèi)外細(xì)胞的滲透壓的功能，繼而達(dá)到提高受精卵成活率和誘導(dǎo)成功率的效果。
[0009]本發(fā)明還可提供了一種使用等滲透壓平衡培養(yǎng)液的誘導(dǎo)鯽魚染色體加倍的方法，特征在于包括以下步驟:Sll催產(chǎn)獲得成熟卵，S12授精獲得受精卵，S13第一次卵裂出現(xiàn)前放入等滲透壓平衡培養(yǎng)液中進(jìn)行熱處理，S14胚胎發(fā)育，S15在所述等滲透壓平衡培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)直至出現(xiàn)魚苗；S16取樣檢測魚苗染色體倍數(shù)。這種誘導(dǎo)方法中S13步驟中熱處理操作可以有效地阻止低倍染色體的鯽魚受精卵在有絲分裂期間的卵裂，有利于將鯽魚染色體進(jìn)行加倍；同時(shí)通過等滲透壓培養(yǎng)液的使用，有效地減少由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差而損失的高倍體細(xì)胞數(shù)量，繼而使得誘導(dǎo)加倍后受精卵的成活率得到提升。
[0010]進(jìn)一步特征在于該誘導(dǎo)方法用于誘導(dǎo)四倍體鯽魚的染色體加倍操作，能夠創(chuàng)造出至今尚未被報(bào)道的八倍體鯽魚。
[0011]優(yōu)選地，每尾鯽魚懷卵量為3-5萬卵。通過添加滲透壓平衡營養(yǎng)液進(jìn)行處理，誘導(dǎo)加倍后受精卵成活率可以達(dá)到0.01%?？紤]到鯽魚的懷卵量為3-5萬卵/尾，受精卵加倍后成活率將處于較高水平。通過該誘導(dǎo)方法處理后鯽魚受精卵的成活率最高可以達(dá)到0.02%,染色體加倍率也可以達(dá)到60%。
[0012]進(jìn)一步特征還在于S14步驟中的等滲透壓平衡培養(yǎng)液中熱處理溫度為41.5-42.5°C，培養(yǎng)時(shí)間為80-105秒，該熱處理?xiàng)l件可使受精卵此次有絲分裂中的卵裂過程更有效地終止，得到八倍體的受精卵細(xì)胞，同時(shí)這些受精卵細(xì)胞也并未失活。
[0013]Sll步驟中采用注射用復(fù)方絨促性素B型，按藥品規(guī)定劑量進(jìn)行注射催產(chǎn)，獲取成熟卵。
[0014]S13步驟中所述授精過程完成后等待lmin，再進(jìn)行步驟S14放入所述等滲透壓平衡培養(yǎng)液中，對(duì)其進(jìn)行所述熱處理。
[0015]熱處理后向等滲透壓平衡培養(yǎng)液中添加鯽魚成熟卵提取促使胚胎發(fā)育，每升熱處理液添加鯽魚成熟卵提取液lmL，用來補(bǔ)充受精卵發(fā)育所需的營養(yǎng)，這也可以進(jìn)一步提高受精卵的成活率。
[0016]S15步驟中在等滲透壓平衡培養(yǎng)液中培養(yǎng)溫度為18-25°C，培養(yǎng)時(shí)間為50_65分鐘，使八倍體的受精卵細(xì)胞分裂并生長。
[0017]S16步驟中通過鏡檢的方法來判斷有絲分裂的時(shí)期。鏡檢時(shí)胚胎染色體制片步驟為S21清洗預(yù)處理；S22細(xì)胞培養(yǎng)；S23低滲處理；S24細(xì)胞固定；S25制片；S26染色；S27鏡檢、拍照及計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。
[0018]本發(fā)明具有以下積極的效果:本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物的染色體工程領(lǐng)域。本發(fā)明的等滲透壓平衡培養(yǎng)液可以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)外的滲透壓。將本發(fā)明的用于鯽魚染色體加倍的誘導(dǎo)過程中，可以有效地減少由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差而損失的高倍體細(xì)胞數(shù)量，繼而使得誘導(dǎo)加倍后受精卵高倍體的成活率大幅提升。更甚者，可以誘導(dǎo)四倍體魚類創(chuàng)造出八倍體的魚類，解決了本【技術(shù)領(lǐng)域】的一種技術(shù)難題，誘導(dǎo)加倍后的八倍體成活率最高可達(dá)到0.02%，染色體加倍成功率可達(dá)到60%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為二倍體染色體鯽魚的鏡檢圖像；
[0020]圖2為四倍體染色體鯽魚的鏡檢圖像；
[0021]圖3為八倍體染色體鯽魚的鏡檢圖像。

【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制，對(duì)本發(fā)明所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0023]本實(shí)施例提供了一種使用了等滲透壓平衡培養(yǎng)液的將鯽魚從四倍體加倍到八倍體的誘導(dǎo)方法。
[0024]等滲透壓平衡培養(yǎng)液的配方為:等滲透壓平衡培養(yǎng)液，特征在于由以下組分構(gòu)成:硝酸鈣90-100mg/L，無水硫酸鎂50-60mg/L，無水磷酸二氫鈉650_700mg/L，氯化鉀400-450mg/L,氯化鈉 8000_8500mg/L，葡萄糖 6000_6500mg/L，余量為去離子水。
[0025]本實(shí)施例中所用動(dòng)物品種為四倍體的鯽魚，所屬長豐鯽，為本單位培育；所采用的用來受精卵子的精子取自雄性興國紅鯉(養(yǎng)殖于中國水產(chǎn)科學(xué)研宄院長江水產(chǎn)研宄所)。注射用復(fù)方絨促性素B型購自寧波三生藥業(yè)有限公司。本實(shí)施例所述的技術(shù)方案，如未特別說明，均為常規(guī)技術(shù)手段；所用試劑如未特別說明，均購自生化商店。
[0026]本實(shí)施例的八倍體鯽魚的誘導(dǎo)方法，步驟如下:
[0027]S31催產(chǎn)獲得成熟卵
[0028]將四倍體鯽魚在春季時(shí)置于16°C以上水溫可使其生長達(dá)到性成熟狀態(tài)；使用注射用復(fù)方絨促性素B型，按藥品規(guī)定計(jì)量進(jìn)行注射催產(chǎn)，獲取成熟卵。
[0029]鯽魚成熟卵提取過程如下:(1)殺掉性成熟鯽魚，取出成熟卵；(2)將成熟卵置于研缽中研磨；(3)將研磨后的卵漿置入50mL離心管中，4000-5000g離心1min后，取上清液；(4)-20 °C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br> [0030]另取少量四倍體鯽魚成熟卵進(jìn)行染色體制片拍照，作為對(duì)照組，結(jié)果如圖1所示。
[0031]S32授精獲得受精卵
[0032]擠取雄性興國紅鯉精液lmL，對(duì)I尾鯽魚的成熟卵進(jìn)行授精，采用常規(guī)授精方式，獲取已授精的受精卵。
[0033]S33胚胎發(fā)育
[0034]授精完成Imin后，將受精卵均勻散布在網(wǎng)片上，置于18_23°C溫水中進(jìn)行胚胎發(fā)育。
[0035]S34選取卵裂期的受精卵
[0036]對(duì)受精卵進(jìn)行鏡檢，當(dāng)胚盤高度隆起時(shí)，受精卵出現(xiàn)稍顯凹陷的卵裂溝，說明此時(shí)該受精卵已接近第一次有絲分裂中后期，第一次卵裂即將發(fā)生。在受精卵在18-23?溫水中發(fā)育50-65min后，可以觀測到受精卵形成的單細(xì)胞球出現(xiàn)凹陷的卵裂溝。
[0037]S35放入等滲透壓平衡培養(yǎng)液(等滲營養(yǎng)液)中進(jìn)行熱處理
[0038]將出現(xiàn)凹陷卵裂溝的受精卵放入等滲營養(yǎng)液中進(jìn)行熱處理，溫度保持在40.5-41.5°C，處理時(shí)間為80-105秒。每增加一升熱處理液則相應(yīng)添加S32步驟中基于成熟卵的提取液體lmL，添加鯽魚成熟卵提取液的目的在于補(bǔ)充卵發(fā)育所需營養(yǎng)。
[0039]等滲透壓平衡培養(yǎng)液配方如下:硝酸鈣90-100mg/L，無水硫酸鎂50_60mg/L，無水磷酸二氫鈉650_700mg/L，氯化鉀400_450mg/L，氯化鈉8000_8500mg/L，葡萄糖6000-6500mg/L,體積余量用去尚子水補(bǔ)足。
[0040]S36在等滲透壓平衡培養(yǎng)液(等滲營養(yǎng)液)中繼續(xù)培養(yǎng)
[0041]將熱處理過的受精卵在18_23°C的等滲營養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，直至孵化出魚苗。
[0042]S37制片觀察
[0043]將魚苗取樣，進(jìn)行染色體制片、染色以及觀察、拍照，確定其倍性，結(jié)果如圖2顯不O
[0044]具體染色體制片過程如下:
[0045](I)預(yù)處理
[0046]取50-100粒發(fā)育至原腸期晚期的魚卵，置于1mL的小燒杯中，用8%的生理鹽水清洗兩遍，清洗時(shí)用大口吸管吸打魚卵，除去魚卵表面污物。
[0047](2)細(xì)胞收集和培養(yǎng)
[0048]清洗清洗完畢后，將生理鹽水棄去。用寬頭鑷快速將魚卵夾破，致使細(xì)胞游離出。加入5mL含1640培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)液，每暈升細(xì)胞培養(yǎng)液含1g秋水仙素和100U的氨節(jié)青霉素。用巴斯德吸管反復(fù)吹吸形成細(xì)胞懸液。用100目的正方形篩絹網(wǎng)過濾，收集篩絹網(wǎng)上細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至5mL離心管中。常溫下處理45秒后，4000g離心5min。操作過程中隔時(shí)吹吸，使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)。
[0049](3)低滲細(xì)胞破裂
[0050]離心后棄去上清液，留0.5mL細(xì)胞沉淀。雖然用手輕敲管底部，使細(xì)胞重懸。隨后加入4ml0.0375mol氯化鉀溶液，低滲處理25min。
[0051](4)固定
[0052]加入0.5-lmL卡諾式固定液(甲醇:冰乙醇體積比為3:1)，習(xí)慣吹吸混勻，4000g離心5min，棄去上清液，留0.5mL細(xì)胞液，加入4-5mL新鮮固定液，重懸。靜置20min，4000g離心5min。重復(fù)固定兩次。
[0053](5)滴片
[0054]棄去上清液，留0.5mL細(xì)胞液，加入l_3mL新鮮固定液，重懸。取冷凍玻片，吸取細(xì)胞懸液滴2-3滴至玻片上，輕輕吹動(dòng)使細(xì)胞鋪散開。傾斜放置，待其自然干燥。
[0055](6)染色
[0056]吉姆薩(Giemsa)染液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)染色lOmin，純凈水洗，自然晾干。
[0057](7)鏡檢與拍照
[0058]利用奧林巴斯CX31顯微鏡進(jìn)行鏡檢，計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。得到結(jié)果受精卵成活率為
0.02%,染色體加倍率為60%。
[0059]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種等滲透壓平衡培養(yǎng)液，其特征在于:所述培養(yǎng)液用于誘導(dǎo)鯽魚染色體的加倍；所述等滲透壓平衡培養(yǎng)液由以下組分構(gòu)成:硝酸鈣90-100mg/L，無水硫酸鎂50-60mg/L，無水磷酸二氫鈉650_700mg/L，氯化鉀400_450mg/L，氯化鈉8000_8500mg/L，葡萄糖6000-6500mg/L,余量為水。
2.如權(quán)利要求1所述的一種等滲透壓平衡培養(yǎng)液，其特征在于，所述鯽魚為四倍體鯽魚。
3.一種誘導(dǎo)魚類染色體加倍的方法，其特征在于:所述魚類為鯽魚；所述誘導(dǎo)方法包括以下步驟: Sll催產(chǎn)獲得成熟卵，S12授精獲得受精卵，S13第一次卵裂出現(xiàn)前放入如權(quán)利要求1所述的等滲透壓平衡培養(yǎng)液中進(jìn)行熱處理，S14胚胎發(fā)育，S15在所述等滲透壓平衡培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)直至出現(xiàn)魚苗；S16取樣檢測魚苗染色體倍數(shù)。
4.如權(quán)利要求3所述的一種誘導(dǎo)魚類染色體加倍的方法，其特征在于:所述鯽魚為四倍體鯽魚。
5.如權(quán)利要求4所述的一種誘導(dǎo)魚類染色體加倍的方法，其特征在于:每尾鯽魚懷卵量為3-5萬卵。
6.如權(quán)利要求4所述的一種誘導(dǎo)魚類染色體加倍的方法，其特征在于:所述S13步驟中的所述等滲透壓平衡培養(yǎng)液中熱處理溫度為41.5-42.5°C，培養(yǎng)時(shí)間為80-105秒。
7.如權(quán)利要求4所述的一種誘導(dǎo)魚類染色體加倍的方法，其特征在于: 所述Sll步驟中采用注射用復(fù)方絨促性素B型，按藥品規(guī)定劑量進(jìn)行注射催產(chǎn)，獲取成熟卵； 所述S13步驟中所述授精過程完成后等待lmin，再進(jìn)行步驟S14放入所述等滲透壓平衡培養(yǎng)液中，對(duì)其進(jìn)行所述熱處理； 所述步驟S14中所述熱處理后向所述等滲透壓平衡培養(yǎng)液中添加鯽魚成熟卵提取促使胚胎發(fā)育，每升熱處理液添加鯽魚成熟卵提取液ImL ; 所述S15步驟中所述培養(yǎng)的溫度為18-25°C，時(shí)間為50-65分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK104498429SQ201410770998
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】李忠, 梁宏偉, 鄒桂偉, 羅相忠 申請(qǐng)人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所