一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別引物和鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于分子生物學(xué)的泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別引物和鑒別方法，其特點是：設(shè)計了特定引物序列：上游引物序列為：5'-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3'(SEQ ID NO.1所示)；下游引物序列為：5'-TGGCATTTCATCAGGGGTG-3'(SEQ ID NO.2所示)。鑒別方法：采用常規(guī)方法提取泥鰍或大鱗副泥鰍樣品的DNA；進行PCR擴增；PCR擴增結(jié)束后，取適量擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，確定擴增片段大小，進行鑒別。鑒別方法準(zhǔn)確、高效。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)區(qū)分法操作困難、分辨成功率低的問題。特別在仔、稚魚階段泥鰍和大鱗副泥鰍很難從外形上分辨，本發(fā)明可提供一種方便、準(zhǔn)確的鑒別方法。
【專利說明】一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別引物和鑒別方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于分子生物學(xué)的泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別引物和鑒別方法，屬于水產(chǎn)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]大鱗副泥嫩(Paramisgurnusdabryanus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)，嫩科(Cobitidae), (Paramisgurnus)。泥嫩(Misgurnus angui I Iicaudatus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)，鰍科(Cobitidae)，泥鰍屬(Misgurnus)。大鱗副泥鰍與泥鰍近緣，外形相似且常同域存在，在我國淡水水域中分布極其廣泛。在國內(nèi)，大鱗副泥鰍和泥鰍均被視為滋補強身的佳品，市場需求缺口大，市場價格年年攀升。國際市場上，大鱗副泥鰍和泥鰍是中國傳統(tǒng)的外貿(mào)出口商品，在日本、韓國和中國港澳臺地區(qū)尤其受歡迎。大鱗副泥鰍比泥鰍具有更快的生長速度和更高的經(jīng)濟價值，所以廣大養(yǎng)殖戶更愿意選擇養(yǎng)殖大鱗副泥鰍。但是這兩種魚在外形上很難區(qū)分，時常發(fā)生泥鰍苗種與大鱗副泥鰍苗種的混淆，并且有不法商販以泥鰍苗種冒充大鱗副泥鰍苗種，造成養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失。國內(nèi)外學(xué)者利用大鱗副泥鰍與泥鰍在外部形態(tài)的差別，建立了若干種區(qū)分兩者的方法。但傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)區(qū)分方法操作起來比較困難，尤其在仔、稚魚階段不易辨別。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對目前現(xiàn)有基于形態(tài)學(xué)判別泥鰍和大鱗副泥鰍方法的不足，提供一種能夠同時鑒別泥鰍和大鱗副泥鰍兩個物種的鑒別引物以及鑒別方法。
[0004]隨著分子標(biāo)記的發(fā)展，如限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)和隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)、微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物的物種鑒別研宄中。線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)具有分子量小，拷貝數(shù)多等特點，已成為魚類進化生物學(xué)和群體遺傳學(xué)研宄的重要分子遺傳標(biāo)記。不同種生物在線粒體DNA上存在著一定的差異，利用這些差異序列，可快速準(zhǔn)確進行種質(zhì)鑒別。本發(fā)明利用大鱗副泥鰍和泥鰍線粒體DNA序列上的差異，設(shè)計一對鑒別特異性引物，利用PCR擴增的產(chǎn)物片段大小來區(qū)分這兩種魚，為鑒別大鱗副泥鰍和泥鰍提供更加準(zhǔn)確的方法。
[0005]本發(fā)明提供一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別引物，包括上游引物和下游引物。上游引物的序列為:5’-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3’ (SEQ ID N0.1所示)；下游引物的序列為:5’ -TGGCATTTCATCAGGGGTG-3’ (SEQ ID N0.2 所示)。
[0006]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種利用上述引物進行泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別的方法，步驟如下:
[0008](I)采用常規(guī)方法提取泥鰍或大鱗副泥鰍樣品的DNA ；
[0009](2)以步驟⑴所述方法得到的DNA為模板，以上述引物對DNA進行PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物；
[0010](3)對步驟⑵獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有285bp的一條帶時，該被測樣品為泥鰍；當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有214bp的一條帶時，該被測樣品為大鱗副泥鰍。
[0011]所述步驟(2) PCR擴增的反應(yīng)體系為:總體積為25 μ L，反應(yīng)體系中各成分濃度或含量為:PCR 緩沖液 1mmoI/L, dNTP 0.2mmol/L，Mg2+L 5mmol/L，上游引物 10 μ mol/L，下游引物10 ymol/L，DNA聚合酶1U,泥鰍或大鱗副泥鰍樣品DNA20ng，余量為雙蒸水。
[0012]所述步驟⑵中PCR擴增使用的PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性5min ;然后30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸60s ;最后在72°C下延伸8min。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)點:
[0014]本發(fā)明所闡述的方法是首次基于線粒體DNA序列差異所建立的一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別新方法。本發(fā)明利用泥鰍和大鱗副泥鰍線粒體基因組中的差異，設(shè)計了一對特異性引物，利用在泥鰍和大鱗副泥鰍上PCR擴增產(chǎn)物大小的差異對這兩種魚進行鑒另O。利用本發(fā)明，能快速高效的對泥鰍和大鱗副泥鰍進行種質(zhì)鑒別，解決了因為專業(yè)魚類分類學(xué)知識和經(jīng)驗不足而造成物種誤判的問題。本發(fā)明尤其適用于苗種階段，也就是仔、稚魚階段泥鰍和大鱗副泥鰍的鑒別，為解決目前泥鰍和大鱗副泥鰍苗種市場的混亂局面提供一種準(zhǔn)確快捷、客觀公正的鑒別方法。本發(fā)明同時可用于研宄泥鰍和大鱗副泥鰍種群分布、資源評估等研宄。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為實施例二的泥鰍和大鱗副泥鰍樣品PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果，其中M為DNAladder (DL500)，Mal_Ma6為泥鰍樣品，Pdl_Pd6為大鱗副泥鰍樣品。
[0016]圖2為實施例三的泥鰍和大鱗副泥鰍樣品PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果，其中M為DNAladder (DL2000)，Mal-15為泥鰍樣品，Pdl-15為大鱗副泥鰍樣品。

【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實施例和說明書附圖對本發(fā)明作進一步闡述。
[0018]實施例一:本發(fā)明提供一對基于線粒體DNA序列差異的鑒別泥鰍和大鱗副泥鰍兩個物種的引物，引物序列為:
[0019]上游引物:5’-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3’(SEQ ID N0.1 所示)；
[0020]下游引物:5’-TGGCATTTCATCAGGGGTG-3’ (SEQ ID N0.2 所示)。
[0021]實施例二:
[0022]本發(fā)明提供一種基于實施例一所述引物鑒別泥鰍和大鱗副泥鰍的方法。本實施例中泥鰍樣品采集于浙江舟山，大鱗副泥鰍樣品采集于河北秦皇島，根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法進行物種鑒別。按照常規(guī)酚/氯仿法進行DNA提取，將采集的樣本置于400 μ L裂解液(NaC150mmol/L, Tris-Cl(pH = 8.0)30mmol/L，EDTA(pH8.0)lOOmmol/L,I % SDS,Proteinase K 200 μ g/mL)中，在50°C溫育至澄清，之后使用等體積的飽和酸:氯仿:異戊醇(25: 24: I)抽提I遍，再用等體積異丙醇沉淀，再用0.4mL 75%乙醇清洗沉淀，之后用TE溶解，并在一 20°C保存?zhèn)溆?。利用實施例一所述的引物對樣品進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為 25 μ L，各種成分濃度為:PCR 緩沖液 10mmol/L，dNTP 0.2mmol/L，Mg2+L 5mmol/L，上游引物和下游引物各10 ymol/L，DNA聚合酶1U,泥鰍或大鱗副泥鰍樣品DNA20ng，用雙蒸水補足到25 μ Lo PCR反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min ;然后30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸60s ;最后在72°C下延伸8min。
[0023]PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀觀察拍照。電泳結(jié)果顯示，6尾形態(tài)學(xué)判定為泥鰍的樣品均出現(xiàn)一條大小為285bp的條帶；6尾形態(tài)學(xué)判定為大鱗副泥鰍的樣品均出現(xiàn)一條大小為214bp的條帶。本方法的鑒別結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)判定的結(jié)果一致，證明本方法的可靠性。
[0024]實施例三:
[0025]如實施例二中所述的鑒別泥鰍和大鱗副泥鰍的方法，不同之處在于本實施例中的泥鰍和大鱗副泥鰍樣品采集于遼寧盤錦，且PCR擴增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色，掃描儀掃描記錄。
[0026]結(jié)果顯示，15尾形態(tài)學(xué)判定為泥鰍的樣品均出現(xiàn)一條大小為285bp的條帶；15尾形態(tài)學(xué)判定為大鱗副泥鰍的樣品均出現(xiàn)一條大小為214bp的條帶。本方法的鑒別結(jié)果與基于形態(tài)學(xué)判定的結(jié)果一致，證明本方法的可靠性。
[0027]本發(fā)明不局限于上述最佳實施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下都可得出其他各種形式的產(chǎn)品，但不論在其形狀或結(jié)構(gòu)上作任何變化，凡是具有與本申請相同或相近似的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物， 所述上游引物的序列為:5’-CCGCCCAGGAGTATTTTATG-3’ ； 所述下游引物的序列為:5’-TGGCATTTCATCAGGGGTG-3’。
2.一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別方法，其特征在于，鑒別步驟如下: (1)提取泥嫩或大鱗副泥嫩樣品的DNA； (2)以步驟(I)中的DNA為模板，以所述引物進行PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物； (3)對步驟⑵獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳分析，當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有285bp的一條帶時，該被測樣品為泥鰍；當(dāng)PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測樣品有214bp的一條帶時，該被測樣品為大鱗副泥鰍。
3.如權(quán)利要求2所述的一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別方法，其特征在于，所述步驟(2)PCR擴增的反應(yīng)體系為:總體積為25 μ L，反應(yīng)體系中各成分濃度或含量為:PCR緩沖液10mmol /T,, dNTP 0.2mmol/L, Mg2+L Smmol /I,,上游引物 10 μ mol/L，下游引物 10 μ mol/L，DNA聚合酶1U,泥鰍或大鱗副泥鰍樣品DNA20ng，余量為雙蒸水。
4.如權(quán)利要求2所述的一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴增使用的PCR擴增程序為:94°C預(yù)變性5min ;然后30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸60s ;最后在72°C下延伸8min。
5.如權(quán)利要求2所述的一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述電泳分析采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。
6.如權(quán)利要求2所述的一種泥鰍和大鱗副泥鰍種質(zhì)鑒別方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述電泳分析采用8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。
【文檔編號】C12N15/11GK104498604SQ201410775974
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】侯吉倫, 劉永富, 劉海金, 王桂興, 張曉彥 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實驗站