人多能干細(xì)胞用培養(yǎng)基質(zhì)及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供能夠在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中使人多能干細(xì)胞在保持多能性的狀態(tài)下進(jìn)行維持培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)以及使用該培養(yǎng)基質(zhì)的人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。在以優(yōu)選0.5μg/cm2～25μg/cm2的濃度涂布有人層粘連蛋白α5β1γ1的E8片段或人層粘連蛋白α3β3γ2的E8片段的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基質(zhì)上，以4×104細(xì)胞/cm2～10×104細(xì)胞/cm2的密度對分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì)胞進(jìn)行接種，由此使人多能干細(xì)胞在保持多能性的狀態(tài)下快速擴增。
【專利說明】人多能干細(xì)胞用培養(yǎng)基質(zhì)及其用途
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01080045114. 8(國際申請?zhí)枮镻CT/JP2010/067618)、中國國 家階段進(jìn)入日為2012年4月6日（國際申請日為2010年10月7日）、發(fā)明名稱為"人多 能干細(xì)胞用培養(yǎng)基質(zhì)及其用途"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及人多能干細(xì)胞用培養(yǎng)基質(zhì)及其用途，具體而言，涉及人多能干細(xì)胞用 培養(yǎng)基質(zhì)、以及使用該培養(yǎng)基質(zhì)的人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法、人多能干細(xì)胞的快速擴增方 法及來源于單個細(xì)胞的人多能干細(xì)胞克隆的分離方法。

【背景技術(shù)】
[0003] 人ES細(xì)胞、人iPS細(xì)胞等人多能干細(xì)胞在再生醫(yī)療中的應(yīng)用正受到全世界的關(guān) 注。但是，為了使人多能干細(xì)胞在保持多能性（pluripotency)的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)、維持，通 常，普遍的方法是使用來源于小鼠或人的成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞來進(jìn)行共培養(yǎng)，而飼養(yǎng) 細(xì)胞的使用已成為人多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用上的巨大制約。為了解決該問題，迄今為止正 在嘗試使用各種粘附蛋白作為人ES細(xì)胞的胞外基質(zhì)來代替飼養(yǎng)細(xì)胞，其中，有報道稱，從 過量產(chǎn)生基底膜的小鼠 EHS肉瘤中提取、純化出的基底膜成分Y卜y (商品名）具有 最高的維持多能性的活性。但是，由于Y卜來源于小鼠，是混有異種蛋白和多糖類的 復(fù)雜的混合物，因此不適于培養(yǎng)用于再生醫(yī)療的人多能干細(xì)胞。
[0004] 為了將人多能干細(xì)胞應(yīng)用于再生醫(yī)療，要求培養(yǎng)環(huán)境滿足：從培養(yǎng)體系中排除異 種來源成分的無異源成分（Xeno-Free)條件和不使用飼養(yǎng)細(xì)胞的無飼養(yǎng)細(xì)胞條件。因此， 正在嘗試使用人玻連蛋白或人纖連蛋白作為同種來源的胞外基質(zhì)，但是，與Y卜卩^少相 比，上述物質(zhì)使人ES細(xì)胞維持未分化的效果差、粘附效率差，在質(zhì)量、材料來源的確保、安 全性等方面存在問題。由此可見，現(xiàn)狀是適于維持培養(yǎng)人多能干細(xì)胞的胞外基質(zhì)的開發(fā)沒 有進(jìn)展，因而迫切要求開發(fā)一種使用化學(xué)組成均一的人源性胞外基質(zhì)的、新的人多能干細(xì) 胞培養(yǎng)技術(shù)。
[0005] 層粘連蛋白是基底膜中的主要的細(xì)胞粘附蛋白，是由α、β、γ鏈這三條亞基鏈 構(gòu)成的異三聚體，是分子量為80萬Da的巨大糖蛋白。三條亞基鏈在C端側(cè)鍵合而形成卷 曲螺旋結(jié)構(gòu)，并通過二硫鍵而形成穩(wěn)定化的異三聚體分子。本發(fā)明人對人ES細(xì)胞所表達(dá)的 整合蛋白的類型進(jìn)行了分析，結(jié)果報道了 α 6β 1整合蛋白是人ES細(xì)胞的主要粘附受體、以 及人層粘連蛋白（特別是由α3β3γ2構(gòu)成的層粘連蛋白332和由α5β1γ1構(gòu)成的層粘 連蛋白511)的重組蛋白對于維持人ES細(xì)胞的多能性有效（參考非專利文獻(xiàn)1)。另外，本 發(fā)明人還報道了層粘連蛋白511對α 6 β 1整合蛋白具有非常高的親和性、以及層粘連蛋白 511的Ε8片段具有與全長的層粘連蛋白511同等的α 6 β 1整合蛋白結(jié)合活性（參考非專 利文獻(xiàn)2)。
[0006] 但是，由于層粘連蛋白與各種細(xì)胞表面分子和細(xì)胞外基質(zhì)分子結(jié)合，因此為了獲 取不含雜質(zhì)且均一的純化層粘連蛋白，需要克服很多技術(shù)問題。另外，由于構(gòu)成層粘連蛋白 的三條亞基鏈的分子量均高達(dá)20萬?40萬Da，因此存在如下問題：直接以重組蛋白的形 式表達(dá)上述亞基鏈結(jié)合而成的異三聚體分子的技術(shù)本身并不容易，且收量也少。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008] 非專利文獻(xiàn)
[0009] 非專利文獻(xiàn) I :Miyazaki T，F(xiàn)utaki S，Hasegawa K，Kawasaki M，Sanzen N，Hayashi M，Kawase E，Sekiguchi K，Nakatsuji N，Suemori R Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.
[0010] 非專利文獻(xiàn) 2 :Taniguchi Y，Ido H，Sanzen N，Hayashi M，Sato-Nishiuchi R，F(xiàn)utaki S，Sekiguchi K. The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem. 284:7820-7831, 2009.


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的目的在于提供能夠在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中使人多能干細(xì)胞在保持 多能性的狀態(tài)下進(jìn)行維持培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)以及使用該培養(yǎng)基質(zhì)的人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方 法。
[0012] 為了解決上述課題，本發(fā)明包含以下的發(fā)明。
[0013] [1] 一種人多能干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基質(zhì)，其特征在于，涂布有人層粘連蛋白 α 5 β 1 γ 1的E8片段或人層粘連蛋白α 3 β 3 γ 2的E8片段。
[0014] [2]如上述[1]所述的培養(yǎng)基質(zhì)，其特征在于，以0· 5 μ g/cm2?25 μ g/cm2的濃度 涂布有人層粘連蛋白α 5 β 1 γ 1的E8片段或人層粘連蛋白α 3 β 3 γ 2的E8片段。
[0015] [3]如上述[1]或[2]所述的培養(yǎng)基質(zhì)，其中，人多能干細(xì)胞為人ES細(xì)胞或人iPS 細(xì)胞。
[0016] [4] -種人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，使用上述[1]?[3]中任一項所 述的培養(yǎng)基質(zhì)。
[0017] [5] -種人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，對分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)， 其特征在于，包括：
[0018] 使人多能干細(xì)胞分散為單個細(xì)胞的步驟，和
[0019] 使用上述[1]?[3]中任一項所述的培養(yǎng)基質(zhì)，對分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。
[0020] [6] -種人多能干細(xì)胞的快速擴增方法，其特征在于，
[0021] 包括：
[0022] 使人多能干細(xì)胞分散為單個細(xì)胞的步驟，和
[0023] 使用上述[1]?[3]中任一項所述的培養(yǎng)基質(zhì)，對分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；并且
[0024] 以2X IO4細(xì)胞/cm2?20X 10 4細(xì)胞/cm 2的密度對分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì) 胞進(jìn)行接種。
[0025] [7] -種來源于單個細(xì)胞的人多能干細(xì)胞克隆的分離方法，其特征在于，
[0026] 包括：
[0027] 使人多能干細(xì)胞分散為單個細(xì)胞的步驟，和
[0028] 使用上述[1]?[3]中任一項所述的培養(yǎng)基質(zhì)，對分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；并且
[0029] 形成來源于單個細(xì)胞的集落。
[0030] [8] -種人多能干細(xì)胞的單個細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，
[0031] 包括：
[0032] 使人多能干細(xì)胞分散為單個細(xì)胞的步驟，和
[0033] 使用上述[1]?[3]中任一項所述的培養(yǎng)基質(zhì)，對分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；并且
[0034] 以單個細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行維持。
[0035] 發(fā)明效果
[0036] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中使人多能干細(xì)胞在保持多 能性的狀態(tài)下進(jìn)行維持培養(yǎng)的培養(yǎng)基質(zhì)以及使用該培養(yǎng)基質(zhì)的人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。 并且，如果組合使用無異源成分的培養(yǎng)基，則能夠在無異源成分且無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培 養(yǎng)人多能干細(xì)胞，從而可以提供安全性高的人多能干細(xì)胞。另外，如果使用本發(fā)明的培養(yǎng)基 質(zhì)，則能夠使分散為單個細(xì)胞的人多能干細(xì)胞快速地擴增，同時能夠分離來源于單個細(xì)胞 的克隆并且能夠以單個細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)行維持。此外，由于涂布在本發(fā)明的培養(yǎng)基質(zhì)上的人 層粘連蛋白α5β1γ1Ε8片段或人層粘連蛋白α3β3γ2的E8片段可以以重組蛋白的形 式高收量地制備，因此，能夠以低成本制備涂布有高純度且均一的人源蛋白質(zhì)的高質(zhì)量的 培養(yǎng)基質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1是表示對人ES細(xì)胞在各種胞外基質(zhì)中的濃度依賴性粘附效率進(jìn)行比較的結(jié) 果的圖。
[0038] 圖2是表示對涂布有人層粘連蛋白α 5 β 1 γ 1的E8片段或Y卜y y少的培養(yǎng)器 皿中依賴于接種密度的單個人ES細(xì)胞的粘附效率進(jìn)行研宄的結(jié)果的圖。
[0039] 圖3是表示涂布有人層粘連蛋白α3β3γ 2的E8片段的培養(yǎng)器皿中的人ES細(xì)胞 的形態(tài)的圖。
[0040] 圖4是表示涂布有人層粘連蛋白α 5 β 1 γ 1的E8片段的培養(yǎng)器皿中的人ES細(xì)胞 的形態(tài)的圖。
[0041] 圖5是表示使用涂布有人層粘連蛋白α3β3γ2的E8片段、人層粘連蛋白 α 5 β 1 γ 1的Ε8片段或Y卜y y少的培養(yǎng)器皿進(jìn)行培養(yǎng)的人ES細(xì)胞的表面抗原分析的結(jié) 果的圖。

【具體實施方式】
[0042] [人多能干細(xì)胞用培養(yǎng)基質(zhì)]
[0043] 本發(fā)明提供涂布有層粘連蛋白α5β1γ1的E8片段或人層粘連蛋白α3β3γ2 的Ε8片段的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基質(zhì)。作為多能干細(xì)胞，可以列舉：ES細(xì)胞（胚胎干 細(xì)胞）、iPS細(xì)胞（人造多能干細(xì)胞）、mGS細(xì)胞（多能生殖干細(xì)胞）、人ES細(xì)胞與體細(xì)胞的 融合細(xì)胞等。
[0044] 人層粘連蛋白α 5β Ιγ?的E8片段（以下記作"人層粘連蛋白511E8"）是指相 當(dāng)于小鼠層粘連蛋白α 1β Ιγ?的Ε8片段（以下記作"小鼠層粘連蛋白111Ε8"）的人層 粘連蛋白α5β1γ1(以下記作"人層粘連蛋白511"）的片段；人層粘連蛋白α3β3γ2的 Ε8片段（以下記作"人層粘連蛋白332Ε8"）是指相當(dāng)于小鼠層粘連蛋白111Ε8的人層粘連 蛋白α3β3γ2(以下記作"人層粘連蛋白332"）的片段。
[0045] 層粘連蛋白的Ε8片段是將小鼠層粘連蛋白α 1 β 1 γ 1 (以下記作"小鼠層粘連蛋 白111"）用彈性蛋白酶進(jìn)行消化而得到的片段中，作為具有強細(xì)胞粘附活性的片段而被 鑒定的片段（Edgar D. , Timpl R. , Thoenen H. The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J. , 3:1463-1468, 1984. >Goodman SL., Deutzmann R. , von der Mark K. Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol. , 105:589-598, 1987.)。推測人層粘連蛋白 511 及 人層粘連蛋白332用彈性蛋白酶進(jìn)行消化時也存在與小鼠層粘連蛋白111E8相當(dāng)?shù)钠危?但是還沒有對它們進(jìn)行分離、鑒定的報道。因此，本發(fā)明所使用的人層粘連蛋白511E8或人 層粘連蛋白332E8不需要為人層粘連蛋白511或人層粘連蛋白332的彈性蛋白酶消化產(chǎn) 物，只要是具有與小鼠層粘連蛋白111E8同樣的細(xì)胞粘附活性、具有同樣的結(jié)構(gòu)、且具有相 同程度的分子量的人層粘連蛋白511或人層粘連蛋白332的片段即可。
[0046] 人層粘連蛋白511E8或人層粘連蛋白332E8的制備方法沒有特別限制，可以列舉 例如：用彈性蛋白酶等蛋白分解酶消化全長的人層粘連蛋白511或人層粘連蛋白332并分 離、純化目標(biāo)片段的方法，以重組蛋白的形式進(jìn)行制備的方法等。從制備量、質(zhì)量的均一性、 制備成本等觀點考慮，優(yōu)選以重組蛋白的形式制備。
[0047] 重組人層粘連蛋白511E8或重組人層粘連蛋白332E8,可以通過適當(dāng)應(yīng)用公知的 基因重組技術(shù)來制備。作為重組人層粘連蛋白511E8的制備方法，例如可以通過如下方法 進(jìn)行制備：分別獲取編碼人層粘連蛋白511E8的α鏈、β鏈及γ鏈的各蛋白的DNA，將其 分別插入表達(dá)載體中，將得到的三種表達(dá)載體共同導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，并 利用公知的方法對形成三聚體的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。本申請發(fā)明人按照Ido等人（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi，Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki，and Kiyotoshi Sekiguchi，''The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins"The Journal of Biological Chemistry，282，11144_11154,2007·)記載的方 法進(jìn)行制備（參考實施例），但是并不限定于此。對于重組人層粘連蛋白332E8,也可以采 用同樣的方法進(jìn)行制備（參考實施例）。另外，分別編碼構(gòu)成人層粘連蛋白511的α 5鏈、 β 1鏈、γ 1鏈和構(gòu)成人層粘連蛋白332的α 3鏈、β 3鏈、γ 2鏈的基因（cDNA)的堿基序 列信息和各鏈的氨基酸序列信息，可以用表1所示的登錄號從公知的數(shù)據(jù)庫（GenBank等） 獲取。
[0048] 表 1
[0049] 人層粘連蛋白序列信息（登錄號）
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種人ES細(xì)胞以外的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基質(zhì)，其特征在于，涂布有人層粘連 蛋白a 5 M y 1的E8片段或人層粘連蛋白a 3 0 3 y 2的E8片段。
2. 如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基質(zhì)，其特征在于，以0. 5 y g/cm2?25 y g/cm2的濃度涂 布有人層粘連蛋白a 5 M Y 1的E8片段或人層粘連蛋白a 3 0 3 Y 2的E8片段。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基質(zhì)，其中，人ES細(xì)胞以外的人多能干細(xì)胞為人iPS 細(xì)胞。
4. 一種人ES細(xì)胞以外的人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1?3 中任一項所述的培養(yǎng)基質(zhì)。
【文檔編號】C12N5/071GK104498430SQ201410776254
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2010年10月7日 優(yōu)先權(quán)日:2009年10月8日
【發(fā)明者】關(guān)口清俊, 二木杉子, 溪口征雅, 林麻利亞, 中辻憲夫, 宮崎隆道, 川瀨榮八郎, 末盛博文 申請人:國立大學(xué)法人大阪大學(xué), 國立大學(xué)法人京都大學(xué)