提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種普魯蘭多糖的制備方法，具體公開了一種提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖，在所述利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖的轉(zhuǎn)化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉(zhuǎn)化液中的濃度為1～30g/L。本發(fā)明通過向轉(zhuǎn)化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，促進(jìn)了胞內(nèi)合成的多糖向胞外分泌，縮短了轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高了普魯蘭生產(chǎn)效率。
【專利說明】提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，涉及一種普魯蘭多糖的制備方法，具體涉及一種提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]普魯蘭多糖(pullulan)是由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)生產(chǎn)的一種粘性胞外多糖，它是由葡萄糖分子按α-1，4_糖苷鍵結(jié)合成麥芽三糖，兩端再以α-1，6-糖苷鍵同另外的麥芽三糖結(jié)合，如此反復(fù)連接而形成高分子量的中性線性多糖。此多糖無色、無味、無毒、無臭，含有豐富的羥基，是非離子性、非還原性多糖，極易溶于水并呈中性，不溶于醇類、油脂、丙酮、醚和氯仿等有機(jī)溶劑。普魯蘭多糖分子內(nèi)獨(dú)特的鏈接方式賦予了它獨(dú)特的理化性質(zhì)，例如:膠粘性、成膜性、成纖性、可塑性及阻氣性等，因而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等各個(gè)領(lǐng)域。如:(1)用于食品保鮮；(2)作為低熱量食品和保健食品的添加劑；(3)作為食品品質(zhì)改良劑和增稠劑；(4)用于制備膠囊、微膠囊、藥物包裝袋等藥物包裝材料和藥物緩釋制劑；(5)作為血漿增量劑；(6)用于制備疫苗；(7)用于污水處理；
(8)用于環(huán)保型包裝材料；(9)用做保護(hù)膜、粘合劑和凝固劑。
[0003]普魯蘭是一種證明有多種實(shí)際用途的獨(dú)特多糖，最早的許多普魯蘭專利涉及大量的工業(yè)化應(yīng)用，例如作為一種絮凝劑用在造紙和涂料的生產(chǎn)中。同樣地，普魯蘭已經(jīng)被認(rèn)為是生物降解材料的取代物，可取代尼龍、人造絲、聚苯乙烯和聚乙烯醇等。然而，普魯蘭昂貴的價(jià)格限制了它的許多潛在應(yīng)用，包括那些作為可生物降解的聚合物取代石油衍生聚合物。盡管普魯蘭能用相對(duì)便宜的原料來發(fā)酵生產(chǎn)，但它目前的價(jià)格仍然是右旋糖苷和黃原膠價(jià)格的近三倍。特別是涉及到人類健康的產(chǎn)品。在很大程度上普魯蘭的生產(chǎn)規(guī)模決定了生產(chǎn)成本。目前，關(guān)于研宄普魯蘭多糖的生產(chǎn)方法很局限，一般都是采用微生物發(fā)酵法，包括搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵罐發(fā)酵，生物膜反應(yīng)器發(fā)酵，并通過優(yōu)化營養(yǎng)環(huán)境條件及發(fā)酵工藝學(xué)手段來提高普魯蘭的產(chǎn)量。普魯蘭生產(chǎn)水平許多年來一直相當(dāng)穩(wěn)定，而在食品上的應(yīng)用是其主要的市場(chǎng)。普魯蘭的另一個(gè)新的市場(chǎng)是膳食增補(bǔ)劑和藥品的膠囊產(chǎn)品。日益增長的需求證明擴(kuò)大普魯蘭生產(chǎn)是正確的，并會(huì)催生這種獨(dú)特的生物聚合物的新的市場(chǎng)前景。
[0004]然而靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化法也是一種合成普魯蘭的方法，它是將微生物培養(yǎng)至一定階段后分離出菌絲體，將其重新懸浮于緩沖液或不完全培養(yǎng)基(缺少某種營養(yǎng)物質(zhì)如氮源等)中，使其處于不再生長但仍保持原有各種酶活的狀態(tài)，然后添加底物，在適當(dāng)溫度、PH和振蕩條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。此法不僅能提高轉(zhuǎn)化效率，還可有效地控制轉(zhuǎn)化液的組成，以適應(yīng)底物轉(zhuǎn)化的最佳條件；同時(shí)減少了培養(yǎng)基成分對(duì)轉(zhuǎn)化過程的影響，便于后期轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離與提純。此法已廣泛應(yīng)用于天然化合物的生物合成、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化、生物催化的有機(jī)化合物不對(duì)稱合成、活性成分篩選及新藥開發(fā)、藥物代謝研宄等諸多領(lǐng)域，但在普魯蘭生產(chǎn)中還未見報(bào)道。
[0005]普魯蘭多糖是在細(xì)胞內(nèi)合成的，然后通過載體脂蛋白作用穿過細(xì)胞壁而分泌到細(xì)胞外。表面活性劑能夠改變細(xì)胞膜的通透性，利于多糖向胞外分泌，降低發(fā)酵產(chǎn)物在胞內(nèi)的濃度，減少產(chǎn)物抑制，縮短發(fā)酵周期。常天俊在2006年報(bào)道，在搖瓶中添加0.05%的吐溫80，吐溫60，吐溫40，結(jié)果表明:這幾種表面活性劑均能促進(jìn)細(xì)胞釋放多糖，其中以吐溫80的效果最佳。斯潘是Span的譯音，在國內(nèi)還有各種譯法，如“斯盤”，“司本”等。但根據(jù)GB-13481-92標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確的譯法應(yīng)為“斯潘”，化學(xué)名為失水山梨醇脂肪酸酷或山梨糖醉脂肪酸酷。它同吐溫一樣，是良好的非離子型表面活性劑，既溶于水也溶于油，能形成水包油和油包水型兩種乳濁液。廣泛地被作為冰淇淋、面包、糕點(diǎn)、起酥油制作過程中的乳化劑，也可作為巧克力、速溶可口、牛奶的分散劑及蜜糖、砂糖、酵母等濃縮時(shí)作為消泡劑等。因此可以通過添加非離子型斯潘類表而活性劑，通過改變細(xì)胞膜的通透性而達(dá)到提高普魯蘭產(chǎn)量的目的。
[0006]雖然已有通過添加吐溫系列的非離子型表而活性劑以提高普魯蘭產(chǎn)量的研宄報(bào)道，但國內(nèi)還沒有通過添加斯潘系列的非離子型表面活性劑對(duì)普魯蘭產(chǎn)量影響的文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法。
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖，在所述利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖的轉(zhuǎn)化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉(zhuǎn)化液中的濃度為I?30g/L。斯潘類非離子型表面活性劑為斯潘20或斯潘40或斯潘60或斯潘80。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)中，出芽短梗霉的培養(yǎng)條件以及利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖的轉(zhuǎn)化條件為:
[0010]⑴菌株
[0011]出芽短梗霉。
[0012]⑵培養(yǎng)基
[0013]斜面培養(yǎng)基(g/L):土豆汁20% (w/v)，葡萄糖20，自然pH ;
[0014]級(jí)利子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母粉 2.5，(NH4) 2S040.6，NaCl I，K2HP045，MgSO4.7H20 0.2，pH 6.5 ；
[0015]二級(jí)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 70，酵母粉 5，(NH4)2SO40.4，NaCl 1，K2HP045，MgSO4.7H20 0.4，pH 6.5 ；
[0016]轉(zhuǎn)化液(g/L):葡萄糖50，MgSO4.7H20 0.2，自然 pH。
[0017]⑶種子培養(yǎng)
[0018]將保存在-70 0C冰箱中的菌種接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)。按10% (v/v)接種量將一級(jí)種子接入二級(jí)種子培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)36小時(shí)。
[0019]⑷搖瓶轉(zhuǎn)化
[0020]將轉(zhuǎn)化用的空錐形瓶、轉(zhuǎn)化液以及配好的斯潘母液于121°C，15min高壓滅菌后備用，收集二級(jí)種子培養(yǎng)液并于25°C 12000rpm的條件下離心20min，無菌操作將離心后的細(xì)胞按一定比例溶于轉(zhuǎn)化液中，并按一定的比例添加斯潘表而活性劑。裝液量依然是500mL三角瓶中裝50mL轉(zhuǎn)化液，在搖床中進(jìn)行靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，轉(zhuǎn)化時(shí)間48小時(shí)。
[0021](5)生物量的測(cè)定
[0022]以細(xì)胞干重(DCW)表示生物量。取20mL轉(zhuǎn)化液，80°C水浴鍋滅活20min，冷卻至室溫，12000rpm離心20min，蒸餾水離心洗滌細(xì)胞沉淀3次，70°C烘干至恒重。
[0023](6)普魯蘭多糖的測(cè)定
[0024]取上述離心后所得的上清液10mL，加入2倍體積無水乙醇4°C沉淀過夜(或12h)，于4°C、12000rpm離心lOmin，棄去上清，留沉淀于70°C烘箱烘干至恒重。
[0025](7)葡萄糖濃度的測(cè)定
[0026]3，5- 二硝基水楊酸法。
[0027]本發(fā)明的提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，采用本發(fā)明特有的方法，利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖的轉(zhuǎn)化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，有效降低了用于細(xì)胞生長所需的底物量，從而提高了普魯蘭的得率；山于通過向轉(zhuǎn)化液中添加斯潘系列非離子型表面活性劑，促進(jìn)了胞內(nèi)合成的多糖向胞外分泌，縮短了轉(zhuǎn)化時(shí)間，提高了普魯蘭生產(chǎn)效率，為提高普魯蘭多糖產(chǎn)量增添了新的方法，也為類似多糖的高產(chǎn)提供了新的思路。因此，本發(fā)明的提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
[0028]上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說明如后。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0030]本發(fā)明的一種提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖，其特征在于:在所述利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖的轉(zhuǎn)化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉(zhuǎn)化液中的濃度為I?30g/L。
[0031]作為本發(fā)明的改進(jìn)，上述斯潘類非離子型表面活性劑的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后的30分鐘之內(nèi)，添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑為斯潘20或斯潘40或斯潘60或斯潘80。
[0032]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述斯潘20的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘20，所述斯潘20在轉(zhuǎn)化液中的濃度為5g/L。
[0033]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述斯潘40的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘40，所述斯潘40在轉(zhuǎn)化液中的濃度為10g/L。
[0034]作為本發(fā)明的進(jìn)步改進(jìn)，上述斯潘60的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘60，所述斯潘60在轉(zhuǎn)化液中的濃度為5g/L。
[0035]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述斯潘80的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘80，所述斯潘80在轉(zhuǎn)化液中的濃度為20g/L。
[0036]實(shí)施例1
[0037]搖瓶轉(zhuǎn)化起始時(shí)不添加表面活性劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0038]轉(zhuǎn)化體系中的細(xì)胞量:14.4g/L ;普魯蘭產(chǎn)量:15.7g/L ;轉(zhuǎn)化時(shí)間48小時(shí)；普魯蘭轉(zhuǎn)化效率:22.7mg/g/ho
[0039]實(shí)施例2
[0040]搖瓶轉(zhuǎn)化起始時(shí)添加斯潘20表面活性劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0041]斯潘20添加濃度:1?30g/L ;轉(zhuǎn)化體系中的細(xì)胞量:11.7g/L ;普魯蘭產(chǎn)量:
14.7?17.lg/L ;轉(zhuǎn)化時(shí)間48小時(shí)；普魯蘭轉(zhuǎn)化效率:26.2?30.4mg/g/h ;斯潘20最佳添加濃度為5g/L。
[0042]實(shí)施例3
[0043]搖瓶轉(zhuǎn)化起始時(shí)添加斯潘40表面活性劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0044]斯潘40添加濃度:1?30g/L;轉(zhuǎn)化體系中的細(xì)胞量:14.3g/L ;普魯蘭產(chǎn)量:18.3?22.5g/L ;轉(zhuǎn)化時(shí)間48小時(shí)；普魯蘭轉(zhuǎn)化效率:26.7?32.8mg/g/h ;斯潘40最佳添加濃度為10g/L。
[0045]實(shí)施例4
[0046]搖瓶轉(zhuǎn)化起始時(shí)添加斯潘60表面活性劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0047]斯潘60添加濃度:1?30g/L;轉(zhuǎn)化體系中的細(xì)胞量:14.4g/L ;普魯蘭產(chǎn)量:
16.1?18.5g/L ;轉(zhuǎn)化時(shí)間48小時(shí)；普魯蘭轉(zhuǎn)化效率:23.3?26.8mg/g/h ;斯潘60最佳添加濃度為5g/L。
[0048]實(shí)施例5
[0049]搖瓶轉(zhuǎn)化起始時(shí)添加斯潘80表面活性劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0050]斯潘80添加濃度:1?30g/L;轉(zhuǎn)化體系中的細(xì)胞量:10.9g/L ;普魯蘭產(chǎn)量:
15.7?21.7g/L ;轉(zhuǎn)化時(shí)間48小時(shí)；普魯蘭轉(zhuǎn)化效率:30.0?41.5mg/g/h ;斯潘80最佳添加濃度為20g/L。
[0051]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，包括利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖，其特征在于:在所述利用出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化合成普魯蘭多糖的轉(zhuǎn)化液中添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑在轉(zhuǎn)化液中的濃度為1?308/1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述斯潘類非離子型表面活性劑的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后的30分鐘之內(nèi)，添加斯潘類非離子型表面活性劑，斯潘類非離子型表面活性劑為斯潘20或斯潘40或斯潘60或斯潘80。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述斯潘20的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘20，所述斯潘20在轉(zhuǎn)化液中的濃度為58/1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述斯潘40的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘40，所述斯潘40在轉(zhuǎn)化液中的濃度為108/1。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述斯潘60的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘60，所述斯潘60在轉(zhuǎn)化液中的濃度為58/1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高出芽短梗霉靜息細(xì)胞生物合成普魯蘭多糖產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述斯潘80的添加時(shí)間為在轉(zhuǎn)化液被配制出來后，立即添加斯潘80，所述斯潘80在轉(zhuǎn)化液中的濃度為208/1。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104450827SQ201410776656
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】衛(wèi)功元, 巨曉敏, 王大慧 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)