一種利用脂肪酶催化合成蝦青素琥珀酸酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及直接以紅法夫酵母菌為原料，利用脂肪酶催化，分離與反應(yīng)耦合合成蝦青素琥珀酸酯的方法。具體方法：紅法夫酵母細(xì)胞經(jīng)高壓勻漿法破碎，離心回收并冷凍干燥后加入異丙醇/正己烷混合溶液進(jìn)行蝦青素萃取，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后直接加入脂肪酶和琥珀酸酐及DMF等反應(yīng)溶劑在溫度20-50℃進(jìn)行酯化即可合成蝦青素琥珀酸酯。此方法對(duì)于解決蝦青素的高度不穩(wěn)定性的問題和生產(chǎn)高效穩(wěn)定的抗氧化劑蝦青素琥珀酸酯方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值與前景。
【專利說(shuō)明】一種利用脂肪酶催化合成蝦青素琥珀酸酯的方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種以紅法夫酵母細(xì)胞為原料采用脂肪酶催化法分離和反應(yīng)耦合制備蝦青素琥珀酸酯的方法，此方法對(duì)于解決蝦青素的高度不穩(wěn)定性的問題和生產(chǎn)高效穩(wěn)定的抗氧化劑蝦青素琥珀酸酯方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值與前景。

【背景技術(shù)】
[0002]蝦青素(3，3’ - 二羥基-4，4’ - 二酮基β_胡蘿卜素)是從河螯蝦外殼、牡蠣和鮭魚中發(fā)現(xiàn)的一種紅色類胡蘿卜素，在細(xì)胞內(nèi)，可與蛋白質(zhì)結(jié)合而成青、藍(lán)色。蝦青素是自然界中最強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化能力是維生素E的1000倍，可有效清除細(xì)胞的氧自由基，增強(qiáng)細(xì)胞再生能力，清除衰老細(xì)胞和維持機(jī)體平衡，具有保護(hù)皮膚，促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，抗衰老、緩解運(yùn)動(dòng)疲勞、增強(qiáng)活力等生物活性。蝦青素已在食品、醫(yī)藥、高端化妝品和保健品等領(lǐng)域廣泛使用。
[0003]蝦青素的來(lái)源有化學(xué)合成和生物獲取兩種方式。利用化學(xué)合成可從胡蘿卜素直接制備蝦青素，但得到的蝦青素結(jié)構(gòu)大多是順式結(jié)構(gòu)，而不是天然生物產(chǎn)物的反式結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)法合成蝦青素成本高，而且產(chǎn)品生物利用率低、活性差，安全性也受到質(zhì)疑。生物法得到的天然蝦青素因生物活性高，安全性好而廣受人們青睞。天然蝦青素的主要生物來(lái)源有甲殼類動(dòng)物、雨生紅球藻和紅法夫酵母菌rAoi/ozjwa)。其中最適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素的是紅法夫酵母菌，因紅法夫酵母菌相對(duì)易培養(yǎng)，短時(shí)間內(nèi)可獲得很高的生物量。但因?yàn)槲r青素極端不穩(wěn)定，在光，熱和輻射等條件易失去生物活性，且紅法夫酵母菌細(xì)胞壁厚難以破碎。從紅法夫酵母細(xì)胞中提取蝦青素，需要用到酸煮等條件劇烈的細(xì)胞壁破碎方法，然后溶劑萃取，溶液濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法)，再續(xù)以結(jié)晶，色譜等手段進(jìn)行純化，由于蝦青素的不穩(wěn)定在分離純化過(guò)程中容易降解，導(dǎo)致最終蝦青素的得率低。
[0004]在蝦青素類產(chǎn)品的儲(chǔ)存、加工過(guò)程中，也由于蝦青素的高度不穩(wěn)定性，導(dǎo)致其活性的大幅度降低而影響其使用效果。如果能將蝦青素轉(zhuǎn)化為蝦青素酯，其不僅具有蝦青素的活性，同時(shí)還因?yàn)樾禄鶊F(tuán)的引入而賦予新的功能，如親疏水性改善，容易消化吸收等。如美國(guó)發(fā)明專利US20050228188 Al中提到蝦青素中鏈脂肪酸酯具有高的消化性和細(xì)胞滲透性。
[0005]本技術(shù)采用分離與反應(yīng)耦合，以紅法夫酵母細(xì)胞為原料直接制備蝦青素琥珀酸酯。首先對(duì)紅法夫酵母細(xì)胞采用高壓勻漿法進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后采用有機(jī)溶劑萃取、濃縮后直接加入脂肪酶和?；噭?琥珀酸酐)催化酯化，在一定條件下反應(yīng)，合成穩(wěn)定性好的蝦青素琥珀酸酯。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、轉(zhuǎn)化率高的利用脂肪酶催化合成蝦青素琥珀酸酯的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種利用脂肪酶催化合成蝦青素琥珀酸酯的方法，該方法具體包括以下步驟:
步驟1:首先將一定量的紅法夫酵母菌的發(fā)酵液用高壓勻漿機(jī)破壁，離心并冷凍干燥后加入足量的正己烷與異丙醇的混合有機(jī)溶劑進(jìn)行蝦青素萃取，得到蝦青素萃取液，備用；
步驟2:將步驟中I得到蝦青素萃取液中加入反應(yīng)溶劑、琥珀酸酐和足量的酵母脂肪酶，在溫度為20_50°C下持續(xù)攪拌反應(yīng)6-72小時(shí)，即可合成蝦青素琥珀酸酯。
[0008]進(jìn)一步，所述正己烷與異丙醇的體積比為2:1。
[0009]進(jìn)一步，所述反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺DMF或二甲基亞砜DMS0，加入量為蝦青素萃取液2-10倍體積。
[0010]進(jìn)一步，所述琥珀酸酐的加入量與蝦青素的摩爾比為50-3000:1。
[0011]本發(fā)明的原理是:蝦青素(3，3’ - 二羥基-4，4’ - 二酮基β-胡蘿卜素)分子具有很長(zhǎng)的共軛雙鍵鏈，兩端各有一個(gè)羥基(-0Η)，每一個(gè)羥基都可以與羧基脫水反應(yīng)生成酯，并且在反應(yīng)過(guò)程中加入脂肪酶催化可以加快反應(yīng)速度。蝦青素的高度不穩(wěn)定性其原因就是因?yàn)閮啥说牧u基極易被氧化，本發(fā)明采用脂肪酶催化，以琥珀酸酐為酯化?；w，將蝦青素一端或兩端的羥基轉(zhuǎn)化成酯基(分別為蝦青素琥珀酸單酯和蝦青素琥珀酸雙酯)，不僅保留了蝦青素本身的生物活性，還大大提高了其穩(wěn)定性，使其更好的應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和保健品等領(lǐng)域。
[0012]本專利的優(yōu)點(diǎn)在于:(I)蝦青素酯的合成傳統(tǒng)方法是從紅法夫酵母菌等生物原料中分離純化得到蝦青素，然后再進(jìn)行酯化。本發(fā)明是直接從紅法夫酵母菌出發(fā)，分離和酶法反應(yīng)耦合直接得到蝦青素琥珀酸酯，這樣部分克服了蝦青素在分離純化過(guò)程中易分解的難題，可提高蝦青素的收率；(2)蝦青素是自然界中天然的抗氧化劑，但極其不穩(wěn)定，在其儲(chǔ)存或加工過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致其活性大幅度降低而影響其功能。而蝦青素琥珀酸酯不僅具有蝦青素的活性，而且比蝦青素更加穩(wěn)定，而且更容易被人體消化和吸收。蝦青素琥珀酸酯在醫(yī)藥，化妝品及保健品等多個(gè)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用潛力。(3)酶法合成琥珀酸酯相對(duì)于化學(xué)法，反應(yīng)條件溫和，合成的蝦青素酯收率高而且產(chǎn)品品質(zhì)好。

【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]以下實(shí)施例中蝦青素轉(zhuǎn)化率是由酯化反應(yīng)中蝦青素的減少量與反應(yīng)前蝦青素量的百分比值計(jì)算得到。
[0015]實(shí)施例1
將2L的紅法夫酵母發(fā)酵液直接采用高壓勻漿機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心回收破碎后的紅法夫酵母細(xì)胞，冷凍干燥后用異丙醇與正己烷的混合溶液(V:V=2:1)進(jìn)行蝦青素萃取，料液比為15mL/g。萃取所得溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后即得蝦青素粗提取液。取1.2mL粗提液，加入反應(yīng)溶劑DMSO 3.SmL和0.2g酵母脂肪酶，并加入琥珀酸酐，使琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比為1500倍，在溫度為35°C恒溫?fù)u床(160 r/min)中反應(yīng)8h，蝦青素轉(zhuǎn)化率為53.70%，其中蝦青素琥珀酸酯中單酯含量82.14%，二酯含量17.86%。
[0016]實(shí)施例2 將2L的紅法夫酵母發(fā)酵液直接采用高壓勻漿機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心回收破碎后的紅法夫酵母細(xì)胞，冷凍干燥后用異丙醇與正己烷的混合溶液(V:V=2:1)進(jìn)行蝦青素萃取，料液比為15mL/g。萃取所得溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后即得蝦青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，加入反應(yīng)溶劑DMF3.8mL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比為1500倍，35°C恒溫?fù)u床(160 r/min)中反應(yīng)6h，蝦青素轉(zhuǎn)化率為25.96%，所生成蝦青素琥珀酸酯均為蝦青素琥珀酸單酯。
[0017]實(shí)施例3
將2L的紅法夫酵母發(fā)酵液直接采用高壓勻漿機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心回收破碎后的紅法夫酵母細(xì)胞，冷凍干燥后用異丙醇與正己烷的混合溶液(V:V=2:1)進(jìn)行蝦青素萃取，料液比為15mL/g。萃取所得溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后即得蝦青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，力口入反應(yīng)溶劑DMS02.4mL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比為1500倍，45°C恒溫?fù)u床(160 r/min)中24h，蝦青素轉(zhuǎn)化率為86.50%，其中蝦青素琥珀酸酯中單酯含量68.01%, 二酯含量31.99%ο
[0018]實(shí)施例4
將2L的紅法夫酵母發(fā)酵液直接采用高壓勻漿機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心回收破碎后的紅法夫酵母細(xì)胞，冷凍干燥后用異丙醇與正己烷的混合溶液(V:V=2:1)進(jìn)行蝦青素萃取，料液比為15mL/g。萃取所得溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后即得蝦青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，加入反應(yīng)溶劑DMS03.SmL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，使琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比為3000倍，35°C恒溫?fù)u床(160 r/min)中反應(yīng)48h，蝦青素轉(zhuǎn)化率為91.40%，其中蝦青素琥珀酸酯中單酯含量40.72%，二酯含量59.28%。
[0019]實(shí)施例5
將2L的紅法夫酵母發(fā)酵液直接采用高壓勻漿機(jī)進(jìn)行細(xì)胞破碎，離心回收破碎后的紅法夫酵母細(xì)胞，冷凍干燥后用異丙醇與正己烷的混合溶液(V:V=2:1)進(jìn)行蝦青素萃取，料液比為15mL/g。萃取所得溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后即得蝦青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，加入反應(yīng)溶劑DMS03.SmL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，使琥珀酸酐與蝦青素的摩爾比為300倍，45°C恒溫?fù)u床(160 r/min)中反應(yīng)72h，蝦青素轉(zhuǎn)化率為70.19%，其中蝦青素琥珀酸酯中單酯含量為88.89%，二酯含量為11.11%。
【權(quán)利要求】
1.一種利用脂肪酶催化合成蝦青素琥珀酸酯的方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟: 步驟1:首先將一定量的紅法夫酵母菌的發(fā)酵液用高壓勻漿機(jī)破壁，離心并冷凍干燥后加入足量的正己烷與異丙醇的混合有機(jī)溶劑進(jìn)行蝦青素萃取，得到蝦青素萃取液，備用； 步驟2:將步驟中I得到蝦青素萃取液中加入反應(yīng)溶劑、琥珀酸酐和足量的酵母脂肪酶，在溫度為20-50°C下持續(xù)攪拌反應(yīng)6-72小時(shí)，即可合成蝦青素琥珀酸酯。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述正己烷與異丙醇的體積比為2:1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺DMF或二甲基亞砜DMSO,加入量為奸青素萃取液2-10倍體積。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述琥珀酸酐的加入量與蝦青素的摩爾比為 50-3000:1。
【文檔編號(hào)】C12P23/00GK104513844SQ201410778784
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】尹春華, 韓燁, 李卉, 馮卓, 閆海, 劉曉璐, 許倩倩, 呂樂 申請(qǐng)人:北京科技大學(xué)