一種檢測人線粒體基因組特異性的引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測人線粒體基因組特異性的引物組，該引物組包括SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.32所示的引物序列。設計16對引物，而后PCR產(chǎn)物直接測序，最后進行拼接的方法，相比于現(xiàn)有技術中長片段測序，本發(fā)明所設計引物的擴增產(chǎn)物覆蓋了整個線粒體的全基因組序列，每對引物的擴增產(chǎn)物長度在1200～1300bp，且相鄰兩對引物獲得的序列重疊100～300bp。因此可以一次性地準確地獲得線粒體基因組的信息，檢測到線粒體基因組上的所有突變，輔助進行線粒體相關疾病的診斷。
【專利說明】-種檢測人線粒體基因組特異性的引物組

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬基因組學領域，涉及一種新型人類線粒體全基因組序列的擴增引物。

【背景技術】
[0002] 線粒體是真核生物細胞內(nèi)非常重要的細胞器，是真核生物進行氧化代謝的主要部 位，是糖類等物質(zhì)在細胞中最終氧化釋放能量的場所。線粒體自身具有一套獨立的基因組， 它只在卵母細胞中進行分裂，因此具有母系遺傳的特點，即只通過女性向下一代進行傳遞。 線粒體DNA基因突變的傳遞有一定數(shù)量上的特點。
[0003] 每個細胞中含有大量線粒體，如果細胞內(nèi)所有的線粒體DNA上的某一位點均為同 一類型的堿基，即全部都是正?；蚧蛲瑸橥蛔兓?，則該細胞為純質(zhì)的；如果細胞內(nèi)所有 的線粒體DNA上的某一位點同時存在正常基因和突變基因，則該細胞為異質(zhì)的。當異質(zhì)率 到達一定的水平后，就有可能對細胞的正常功能產(chǎn)生影響。
[0004] 研究顯示，線粒體基因的突變會導致：KSS綜合癥，Leigh氏病或稱亞急性壞死性 腦肌病，ELAS綜合癥，MERRF綜合癥，Leber氏遺傳性視神經(jīng)萎縮癥，Alper綜合癥，慢性進 行性外眼肌麻痹，線粒體神經(jīng)消化道腦肌病，Pearson綜合癥等。
[0005] 長片段測序，對于樣品以及Taq酶要求較高，也不能保證較高的準確性。本法方法 設計16對引物，而后PCR產(chǎn)物直接測序，最后進行拼接的方法，能有效地提高數(shù)據(jù)的準確 率，同時還能檢測出線粒體基因的異質(zhì)率。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種檢測人線粒體基因組特異性的引 物組，利用提供的引物，擴增出人類線粒體基因組的片段后進行測序拼接，從而確定某個人 類個體的線粒體全基因組序列，在對其進行突變位點分析后，為線粒體相關疾病的治療和 預防提供相關依據(jù)。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：一種檢測人線粒體基因組特異性的引 物組，該引物組包括： 第一引物對：如SEQ ID NO. 1所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 2所示的的反向引物； 第二引物對：如SEQ ID NO. 3所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 4所示的的反向引物； 第三引物對：如SEQ ID NO. 5所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 6所示的的反向引物； 第四引物對：如SEQ ID NO. 7所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 8所示的的反向引物； 第五引物對：如SEQ ID NO. 9所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 10所示的的反向引物； 第六引物對：如SEQ ID NO. 11所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 12所示的的反向引 物； 第七引物對：如SEQ ID NO. 13所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 14所示的的反向引 物； 第八引物對：如SEQ ID NO. 15所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 16所示的的反向引 物； 第九引物對：如SEQ ID NO. 17所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 18所示的的反向引 物； 第十引物對：如SEQ ID NO. 19所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 20所示的的反向引 物； 第H^一引物對：如SEQ ID NO. 21所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 22所示的的反向引 物； 第十二引物對：如SEQ ID NO. 23所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 24所示的的反向引 物； 第十三引物對：如SEQ ID NO. 25所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 26所示的的反向引 物； 第十四引物對：如SEQ ID NO. 27所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 28所示的的反向引 物； 第十五引物對：如SEQ ID NO. 29所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 30所示的的反向引 物； 第十六引物對：如SEQ ID NO. 31所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 32所示的的反向引 物。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明設計16對引物，而后PCR產(chǎn)物直接測序，最后進行拼 接的方法，相比于現(xiàn)有技術中長片段測序，本發(fā)明所設計引物的擴增產(chǎn)物覆蓋了整個線粒 體的全基因組序列，每對引物的擴增產(chǎn)物長度在1200?1300bp，且相鄰兩對引物獲得的序 列重疊100?300bp。因此可以一次性地準確地獲得線粒體基因組的信息，檢測到線粒體基 因組上的所有突變，輔助進行線粒體相關疾病的診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 圖1是實施例1中提取的人類基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0010] 圖2是實施例1中人類基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0011] 由于擴增大片段的線粒體基因組對樣品質(zhì)量以及Taq酶有很高的要求，一次性擴 增出線粒體基因組會有較高的錯配率。目前最準確的Sanger測序方法有效讀取長度為 700-800bp。本發(fā)明使用16對引物分別擴增出片段，而后進行拼接，能提高數(shù)據(jù)的準確性。 下面將本發(fā)明的16個引物對應用于人線粒體基因組特異性檢測，以進一步說明本發(fā)明。
[0012] 1.選擇研究對象：實驗標本來自上海血庫，共8個標本。
[0013] 2.全基因組DNA的抽提：按血液基因組DNA抽提試劑盒操作說明進行操作，試劑 盒為DNeasyBlood&TissueKit。提取后DNA電泳圖參見圖1。
[0014] 3.弓丨物設計： 第一引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 1)為5' -TTAACCACTCACGGGAGCT-3'，反向 引物的序列（SEQ ID NO. 2)為 5' -GGTTTGCTGAAGATGGCGGT-3' ； 第二引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 3)為5' -CCCCACTATGCTTAGCCCTA-3'，反向 引物的序列（SEQ ID NO. 4)為 5' -ATCTGACGCAGGCTTATGC-3' ； 第三引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 5)為5' -ACAGCTCTTTGGACACTAGGA-3'，反 向引物為的序列（SEQ ID NO. 6)為 5' -TTAGGAATGCCATTGCGAT-3' ； 第四引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 7 )為5 ' -CCGGAGTAATCCAGGTCGGT-3 '，反向 引物的序列（SEQ ID NO. 8)為 5' -AGGTTTGAGGGGGAATGCTG-3' ； 第五引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 9 )為5 ' -TTCGAACAGCATACCCCCGA-3 '，反向 引物的序列（SEQ ID NO. 10)為 5' -CCATTTGGGCAAAAAGCCGGT-3' ； 第六引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 11)為5' -CAGTTCTACCGTACAACCCT-3'，反 向引物的序列（SEQ ID NO. 12)為 5' -GGGAGTAGTTCCCTGCTAAGG-3' ； 第七引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 13)為5'-ATAATCGGAGGCTTTGGCA-3'，反向 引物的序列（SEQ ID NO. 14)為 5' -GTCACTCCAGGTTTATGGAGG-3' ； 第八引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 15)為5'-CCCACAACACTTTCTCGGCCT-3'，反 向引物的序列（SEQ ID NO. 16)為 5' -TTATGGTGGGCCATACGGT-3' ； 第九引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 17)為5'-ACTTTCACCGCTACACGAC-3'，反向 引物的序列（SEQ ID NO. 18)為 5' -GGCCTTTTTGGACAGGTGGT-3' ； 第十引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 19)為5' -GTAAAACCCAGCCCATGAC-3'，反向 引物的序列（SEQ ID NO. 20)為 5' -TAAATGAGGGGCATTTGGT-3' ； 第i^一引物對的正向引物的序列（SEQ ID NO. 21)為 5 ' -GCCCTAAGTCTGGCCTATGAG-3 '， 反向引物的序列為（SEQ ID NO. 22)為 5' -CTACGAGGGCTATGTGGCT-3' ； 第十二引物對的的正向引物的序列（SEQ ID NO. 23 )為5 ' -AAAACTAGGCGGCTATGGT-3 '， 反向引物的序列為（SEQ ID NO. 24)為 5' -ACGAACAATGCTACAGGGA-3' ； 第十三引物對的的正向引物的序列（SEQ ID NO. 25)為5' -GACACTGAGCCACAACCCA-3'， 反向引物的序列（SEQ ID NO. 26)為 5' -TGACAGCGAGGGCTGTGAG-3' ； 第十四引物對的的正向引物的序列（SEQ ID NO. 27)為5' -ACAGGTCAACCTCGCTTCC-3'， 反向引物的序列為（SEQ ID NO. 28)為 5' -AAAGGCGGTTGAGGCGTCTG-3' ； 第十五引物對的的正向引物的序列（SEQ ID NO. 29)為 5' -ATTCTCGCACGGACTACAACC-3'，反向引物的序列（SEQ ID NO. 30)為 5, -ACTACAAGGACAGGCCCAT-3,； 第十六引物對的的正向引物的序列（SEQ ID NO. 31)為5' -AACTAGGAGGCGTCCTTGC-3'， 反向引物的序列（SEQ ID NO. 32)為 5' -GGAAAGTGGCTGTGCAGAC-3' ； 4. PCR擴增：將干粉狀的引物稀釋到工作濃度10mM，PCR擴增體系為20ul，其中包括基 因組DNA模板Iul(模板濃度至少為20ng/ul)，正反向引物各lul，10XPCR Buffer 2μ 1 (含 Mg2+)，dNTPs (0.2mM Each) 4 μ 1，Hotstar Taq lu。使用 PCR 儀為 ABI 2720 Thermal Cycler ； 擴增條件為：94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分30秒， 35個循環(huán)后，72 °C延伸10分鐘，最后4°C終止反應。
[0015] 5. PCR產(chǎn)物電泳鑒定： 稱取2g瓊脂糖放于錐形瓶中，再量取200ml的I XTBE溶液混合，放于微波爐中煮沸， 至溶液清徹透明為止。冷卻到60°C時加2μ 1核酸染料，搖勻。
[0016] 組裝好制膠器，并調(diào)至水平。將膠倒于制膠器中，插好梳子。待40分鐘膠冷卻凝 固后，就可放于倒好電泳緩沖液的電泳槽中進行點樣。
[0017] 取5 μ 1樣品溶液，加1-2 μ I 6 X loading Dye，混合均勻后進行點樣。調(diào)電泳儀 各參數(shù)進行電泳：U :150V ;A ; 150mA ;T :30min。
[0018] 16對引物經(jīng)行PCR后，PCR產(chǎn)物的電泳圖如圖2所示。
[0019] 6.將每個樣品所有的16條PCR產(chǎn)物送杭州吉洛生物科技有限公司進行測序，測 序引物為PCR擴增相對應的16對上下游引物。
[0020] 7.測序結果使用MutationSurveyor軟件與在NCBI網(wǎng)站上公布的人類線粒體基 因組序列（NC_012920. 1)進行比對，同時對基因的突變位點進行分析。經(jīng)過比對，序列的覆 蓋度達到100%， 表1 :8個樣本中所發(fā)現(xiàn)的突變位點

【權利要求】
1. 一種檢測人線粒體基因組特異性的引物組，其特征在于，該引物組包括： 第一引物對：如SEQ ID NO. 1所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 2所示的的反向引物； 第二引物對：如SEQ ID NO. 3所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 4所示的的反向引物； 第三引物對：如SEQ ID NO. 5所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 6所示的的反向引物； 第四引物對：如SEQ ID NO. 7所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 8所示的的反向引物； 第五引物對：如SEQ ID NO. 9所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 10所示的的反向引物； 第六引物對：如SEQ ID NO. 11所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 12所示的的反向引 物； 第七引物對：如SEQ ID NO. 13所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 14所示的的反向引 物； 第八引物對：如SEQ ID NO. 15所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 16所示的的反向引 物； 第九引物對：如SEQ ID NO. 17所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 18所示的的反向引 物； 第十引物對：如SEQ ID NO. 19所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 20所示的的反向引 物； 第i^一引物對：如SEQ ID NO. 21所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 22所示的的反向引 物； 第十二引物對：如SEQ ID NO. 23所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 24所示的的反向引 物； 第十三引物對：如SEQ ID NO. 25所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 26所示的的反向引 物； 第十四引物對：如SEQ ID NO. 27所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 28所示的的反向引 物； 第十五引物對：如SEQ ID NO. 29所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 30所示的的反向引 物； 第十六引物對：如SEQ ID NO. 31所示的的正向引物；如SEQ ID NO. 32所示的的反向引 物。
【文檔編號】C12N15/11GK104480207SQ201410780562
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月17日 優(yōu)先權日:2014年12月17日
【發(fā)明者】李洲, 范嘉庚, 李航 申請人:杭州吉洛生物醫(yī)藥科技有限公司