草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法，具體包括如下步驟：(1)田間草莓苗提取總RNA：(2)總RNA反轉錄為cDNA(3)設計四種病毒引物；(4)單一RT-PCR檢測田間苗；(5)多重RT-PCR病毒檢測體系：本發(fā)明在利用單一RT-PCR檢測SVBV、SMYEV、SMoV和SCV的基礎上，通過優(yōu)化影響多重RT-PCR的因子，建立起多重RT-PCR檢測SVBV、SMYEV、SMoV和SCV四種常見草莓病毒的技術體系。
【專利說明】草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物的病原體檢測方法，尤其涉及一種草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法。

【背景技術】
[0002]草莓(FragariaXananassaDuch.)是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)宿根性多年生常綠草本植物。果實鮮嫩多汁、色澤艷麗、香氣怡人、口感酸甜適中，是我國傳統(tǒng)的優(yōu)秀漿果果品之一。草莓果實富含維生素C、有機酸、糖、礦物質(zhì)及果膠等多種營養(yǎng)成分。近年來研宄發(fā)現(xiàn)草莓所含的親花單寧(Ellagitannins)、花青素(Anthocyanins)和原花青素(Proanthocyanidins)等生物活性物質(zhì)能預防心腦血管和癌癥的發(fā)生，因此草莓倍受消費者青睞。
[0003]草莓繁殖常采用傳統(tǒng)的匍匐莖埋壓或分株繁殖，這種無性繁殖方式提高了病毒侵染植株的幾率，病毒侵染草莓植株后將破壞細胞的代謝，使其表現(xiàn)出生長緩慢、植株矮小、葉片失綠或變色等特征，從而嚴重影響果實品質(zhì)和產(chǎn)量，嚴重減產(chǎn)可達30%?80%。目前，已發(fā)現(xiàn)約62種侵染草莓的病毒，其中以草莓皺縮病毒(Strawberry crinkle virus，SCV)、草莓斑駁病毒(Strawberry mottle virus，SMoV)、草莓輕型黃邊病毒(Strawberry mildyellow edge virus, SMYEV)和草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus, SVBV)四種病毒浸染造成的危害最為嚴重。在栽培過程中，這四種病毒往往同時存在，單獨侵染時，除草莓皺縮病毒外其他三種病毒都不表現(xiàn)出明顯癥狀，但會導致植株矮小、產(chǎn)量下降和品質(zhì)變劣，造成嚴重的經(jīng)濟損失。
[0004]種苗是生產(chǎn)的起點，脫毒苗的病毒檢測是脫毒苗進行田間生產(chǎn)的前提。由于草莓大多數(shù)受到多種病毒復合侵染，若利用多重RT-PCR病毒檢測體系將有效解決單一 PCR(聚合酶鏈式擴增反應)或者RT-PCR(逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應)檢測病毒，同一個樣需要多次檢測的問題，大大減輕了工作量。專利號201210403587.1發(fā)明了四快速檢測四種病毒的多重RT-PCR方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明就是針對上述問題，提出一種草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法，該方法利用單一 RT-PCR檢測SVBV、SMYEV, SMoV和SCV的基礎上，通過優(yōu)化影響多重RT-PCR的因子，建立起多重RT-PCR檢測SVBV、SMYEV, SMoV和SCV四種常見病毒的技術體系O
[0006]為達到上述技術目的，本發(fā)明采用了一種草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法，具體包括如下步驟:
[0007](I)田間苗提取總RNA:采用改良3% CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取草莓葉片總RNA ；
[0008](2)總RNA反轉錄為cDNA (互補脫氧核糖核酸):以提取的總RNA (DNA酶處理)逆轉錄產(chǎn)物(cDNA)為模板，內(nèi)參引物對為295bp大小，進行常規(guī)PCR反應；
[0009](3)設計四種病毒引物；
[0010](4)單一 RT-PCR檢測田間苗:取逆轉錄產(chǎn)物cDNA I μ I進行單一 PCR反應，檢測試驗材料草莓中是否含有四種常見草莓病毒。PCR體系中所加的引物為篩選的合適引物，濃度為0.2 μ mo I.L-1 (20 μ I體系中加I μ I)，體系中還包括:TaqMix (DNA聚合酶混合物)10ml，用超純水補充至20 μ 1，整個操作必須在冰上進行。PCR反應程序為:94°C，3min ；94°C，Imin ;退火溫度(SCV1/SCV2 為 58°C，SMoVl/SMoV2 為 60°C，SMYEV1/SMYEV2 為 50°C，SVBV1/SVBV2 為 52°C、Actinl/Actin2 為 57°C )，40s ;72°C，40s，35 個循環(huán)；最后 72°C延伸5min。用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳EB染色檢測擴增產(chǎn)物；
[0011](5)多重RT-PCR病毒檢測體系:根據(jù)已篩選出的適合多重RT-PCR反應的引物，通過對PCR體系的不斷優(yōu)化，尋找出適合多重引物的最優(yōu)PCR條件。多重PCR體系中，引物濃度為(0.1 ?0.5 μ mo I *L-1) ,20mmol.L-1MgCl2 濃度為(1.6 ?2.4 μ I)，10XPCR Buffer (10倍PCR緩沖液)2 μ 1，dNTPs (脫氧核糖核苷三磷酸)0.2 μ 1，DNA聚合酶0.4 μ 1，最后用超純水補足至20 μ I。PCR反應的退火溫度為(52°C?58°C )，退火時間為40s，延伸溫度(68°C?72°C )和延伸時間(40s?2.0min)在多重PCR中被試驗。用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳EB (溴化乙錠)染色檢測擴增產(chǎn)物。
[0012]本發(fā)明能夠建立起多重RT-PCR檢測體系，可以同時檢測四種草莓病毒，節(jié)約了時間，大大減輕了病毒檢測的工作量。并且穩(wěn)定性好，重復性高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1所示的是本發(fā)明中提取的草莓葉片總RNA的電泳檢測結果狀態(tài)圖；
[0014]圖2所示的是本發(fā)明中Actin引物電泳結果狀態(tài)圖；
[0015]圖3所示的是本發(fā)明中四種病毒單一 RT-PCR電泳結果狀態(tài)圖；
[0016]圖4所示的是本發(fā)明中草莓四種病毒SMYEV、SMV、SCV和SVBV的多重RT-PCR電泳檢測結果狀態(tài)圖；

【具體實施方式】
[0017]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細地說明。
[0018]草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法，具體包括如下步驟:
[0019](I)田間苗提取總RNA:采用改良3% CTAB法提取草莓葉片總RNA ;1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示:28S、18S和5S清晰可見，且28S亮度是18S亮度的兩倍(圖1)，說明提取的RNA的完整性較好。通過Eppendorf B1phtometer (蛋白核酸分析儀)測定260nm、280nm處的光吸收值(0D值)和RNA的濃度，0D260/0D280值在1.90?1.98之間，0D260/0D230值在2.05?2.30之間，濃度在500?700 μ g/ml之間，能夠滿足下一步進行反轉錄實驗的要求(參見圖1);
[0020](2)總RNA反轉錄為cDNA:以提取的總RNA(DNA酶處理)逆轉錄產(chǎn)物(cDNA)為模板，內(nèi)參引物對為295bp大小，進行常規(guī)PCR反應；從結果來看:得到單一特異、清晰的目的片段擴增產(chǎn)物(295bp)。因此，逆轉錄產(chǎn)物是可以用于后續(xù)的多重RT-PCR試驗(參見圖2)。
[0021](3)設計四種病毒引物；
[0022](4)單一 RT-PCR檢測田間苗:取逆轉錄產(chǎn)物cDNA I μ I進行單一 PCR反應，檢測試驗材料草莓中是否含有四種常見草莓病毒。PCR體系中所加的引物為篩選的合適引物，濃度為0.2 μ mo I.L-1 (20 μ I體系中加I μ I)，體系中還包括:TaqMix 10ml，用超純水補充至20 μ I，整個操作必須在冰上進行。PCR反應程序為:94°C，3min ;94°C，Imin ;退火溫度(SCV1/SCV2 為 58°C，SMoVl/SMoV2 為 6(TC，SMYEV1/SMYEV2 為 5(TC，SVBV1/SVBV2 為 52°C、Actinl/Actin2 為 57°C )，40s ;72°C，40s，35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 5min。用 2.0% 的瓊脂糖凝膠電泳EB染色檢測擴增產(chǎn)物(參見圖3);
[0023](5)多重RT-PCR病毒檢測體系:根據(jù)已篩選出的適合多重RT-PCR反應的引物，通過對PCR體系的不斷優(yōu)化，尋找出適合多重引物的最優(yōu)PCR條件。多重PCR體系中，引物濃度為(0.1 ?0.5 μπιο?.L-1)，20mmol.L4MgCl2濃度為(1.6 ?2.4 μ I)，10XPCR Buffer2 μ 1，dNTPs 0.2 μ 1，Taq酶0.4 μ 1，最后用超純水補足至20 μ I。PCR反應的退火溫度為(52°C~ 580C )，退火時間為40s，延伸溫度(68°C~ 72°C )和延伸時間(40s?2.0min)在多重PCR中被試驗。用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳EB染色檢測擴增產(chǎn)物(參見圖4)。
【權利要求】
1.草莓超低溫療法脫毒再生苗病原體檢測的方法，其特征在于，具體包括如下步驟: (1)田間苗提取總RNA:采用改良3% CTAB法提取草莓葉片總RNA ； (2)總RNA反轉錄為cDNA:以提取的總RNA逆轉錄產(chǎn)物為模板，內(nèi)參引物對為295bp大小，進行常規(guī)PCR反應； (3)設計四種病毒引物； (4)單一RT-PCR檢測田間苗:取逆轉錄產(chǎn)物cDNA I μ I進行單一 PCR反應，檢測試驗材料草莓中是否含有四種常見草莓病毒，PCR體系中所加的引物為篩選的合適引物，濃度為0.2 μ mo I *L_1，體系中還包括:TaqMix 10ml，用超純水補充至20 μ 1，整個操作必須在冰上進行；PCR反應程序為:94°C，3min ;94°C，lmin ;退火溫度，40s ;72°C，40s，35個循環(huán)；最后72°C延伸5min，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳EB染色檢測擴增產(chǎn)物； (5)多重RT-PCR病毒檢測體系:根據(jù)已篩選出的適合多重RT-PCR反應的引物，通過對PCR體系的不斷優(yōu)化，尋找出適合多重引物的最優(yōu)PCR條件，多重PCR體系中，引物濃度為0.1 ?0.5 μπιο?.L-l，20mmol.L-lMgC12 濃度為 1.6 ?2.4μ 1，10XPCR Buffer 2 μ I,dNTPs 0.2 μ I, Taq酶0.4 μ 1，最后用超純水補足至20 μ 1，PCR反應的退火溫度為52°C?58°C，退火時間為40s，延伸溫度68°C?72°C和延伸時間40s?2.0min在多重PCR中被試驗，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳EB染色檢測擴增產(chǎn)物。
【文檔編號】C12R1/94GK104480222SQ201410784226
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權日:2014年12月16日
【發(fā)明者】羅婭, 湯浩茹, 邱靜, 王小蓉, 張勇, 陳清, 孫勃, 鄧群仙, 李雁翎, 田鈺 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學