檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的方法及試劑盒。該方法包括如下步驟：設(shè)計(jì)擴(kuò)增肺癌三個(gè)相關(guān)基因的擴(kuò)增引物，接著將擴(kuò)增引物配成引物混合液，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)果用GeneMapper4.1分析，判讀結(jié)果。依據(jù)該方法設(shè)計(jì)得到的試劑盒，含有如SEQ ID NO.1～6所示的引物序列。本發(fā)明提供的方法和試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)：通量高，一次單管同時(shí)檢測三個(gè)基因的多態(tài)性；步驟簡單，僅需一次PCR擴(kuò)增及一次毛細(xì)管電泳便可獲得結(jié)果；檢測周期短，僅需半個(gè)工作日便可完成檢測。
【專利說明】檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的方法及試 劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于臨床生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān) 基因多態(tài)性的方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌的發(fā)病率及病死率在腫瘤中均位于首位。傳統(tǒng)的治療方法是基于病人的臨床 特征及病理類型選擇化學(xué)治療方案，但無疾病進(jìn)展期（PFS)只有6個(gè)月。近年來，肺癌的靶 向治療取得了顯著進(jìn)展，以表皮生長因子（EGFR)為靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑（吉非 替尼及?？颂婺幔┰诤舾型蛔冃虴GFR的非小細(xì)胞肺癌患者中顯示出顯著的療效，PFS達(dá) 到了 9-13個(gè)月。然而，吉非替尼在EGFR敏感突變型肺癌的療效僅達(dá)70%，研宄顯示，EGFR intronl CA多態(tài)性與吉非替尼的療效相關(guān)。EGFR的轉(zhuǎn)錄由兩個(gè)增強(qiáng)子調(diào)控，一個(gè)位于轉(zhuǎn)錄 起始點(diǎn)的上游，另一個(gè)在第一內(nèi)含子的CA重復(fù)區(qū)，CA的長度在不同種族有差異，文獻(xiàn)報(bào)道： CA區(qū)的長度約為14-21CA，但在本發(fā)明單位前期研宄中發(fā)現(xiàn)，中國人的EGFR intronl CA的 長度可長達(dá)22個(gè)，而14個(gè)CA極其罕見，其臨床意義有待進(jìn)一步研宄。CA區(qū)長度多態(tài)性與 EGFR的轉(zhuǎn)錄相關(guān)，即短的CA，則EGFR轉(zhuǎn)錄水平較高，其表達(dá)水平也較高，EGFR的過表達(dá)提 示不良的預(yù)后。而較長的CA重復(fù)提示良好的生存率；較短的CA重復(fù)，提示EGFR高表達(dá)，在 肺癌靶向治療中對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑敏感。
[0003] 不同文獻(xiàn)計(jì)算CA長度的cutoff值（截?cái)嘀担┑姆椒ú灰粯樱瑢?dǎo)致結(jié)果有所差異。 有的文獻(xiàn)是以兩個(gè)等位基因中最短的CA長度來判斷截?cái)嘀担欢械奈墨I(xiàn)是將兩個(gè)同位基 因CA值的總和來判斷截?cái)嘀?，這樣就需要準(zhǔn)確計(jì)算兩個(gè)等位基因的長度。用經(jīng)典的Sanger 測序法未能較清晰地將EGFRintronlCA的雜合子及純合子區(qū)分出來，對(duì)準(zhǔn)確計(jì)數(shù)CA的長 度有較大的影響。
[0004] 此外，研宄提示：基因的上調(diào)是EGFR TKI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡所需，在亞裔人口中 基因的第二內(nèi)含子存在著缺失多態(tài)性，在高加索人群中卻未發(fā)現(xiàn)。并且基因的缺失 多態(tài)性與EGFR_TKI耐藥相關(guān)，添加基因BH3模擬分子，可以克服缺失導(dǎo)致的耐藥。 我們?cè)缙谡{(diào)查數(shù)據(jù)提示：在中國人口中，BIM基因的缺失多態(tài)頻率約為18%。
[0005] 依立替康可用于非小細(xì)胞肺癌及小細(xì)胞肺癌治療。該藥可引起嚴(yán)重的腹瀉及中性 粒細(xì)胞減少等毒副作用，延遲性腹瀉為劑量限制性。當(dāng)出現(xiàn)嚴(yán)重毒副作用時(shí)，下一周期可減 少劑量或延遲給藥。UGT1基因表達(dá)9個(gè)功能性的UGT1A蛋白，UGT1A1蛋白是主要催化SN-38 葡萄糖苷酸及膽紅素的蛋白。UGT1A1突變導(dǎo)致其活性減低或缺失，從而使非結(jié)合性膽紅素 增高，尤其是在其TA盒插入TA的突變，使得酶的活性減低及SN-38葡萄糖苷酸化，致使依 立替康毒性增加，但只要減少給藥量則不影響療效。UGT1A1 TA盒的多態(tài)性為：突變型：6/7 型及7/7型，野生型為：6/6型.
[0006] 因此，更多地了解患者的肺癌基因的信息，有助于更好對(duì)肺癌患者實(shí)施精準(zhǔn)治療。 目前，Sanger測序法為突變檢測的經(jīng)典方法，但Sanger測序法耗時(shí)、通量低，每次僅能檢測 一個(gè)片段的突變，而且操作復(fù)雜。相比Sanger測序法，本發(fā)明方法通量較高，可單管同時(shí)檢 測三個(gè)基因的多態(tài)性，而且操作簡便、流程短，能快速、準(zhǔn)確地獲得檢測結(jié)果，節(jié)省試劑、節(jié) 省時(shí)間，減少檢測成本、減少核酸樣本的使用量，更重要的是減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測肺癌治療耐藥 及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的方法。該方法為應(yīng)用多重PCR方法檢測肺癌靶向治療和化 療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性。本發(fā)明所指的肺癌治療耐藥及毒副作用基因?yàn)镋GFR intronl、及UGT1A1等三個(gè)與肺癌靶向治療或化學(xué)治療耐藥或毒副作用相關(guān)基因。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的試 劑盒。
[0009] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基 因多態(tài)性的方法，包括如下步驟：
[0010] (1)設(shè)計(jì)擴(kuò)增肺癌三個(gè)相關(guān)基因多態(tài)性區(qū)域的擴(kuò)增引物
[0011] 擴(kuò)增UGT1A1基因的引物對(duì)如下：
[0012] UGT1A1_F :5' -VIC-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA-3' ；
[0013] UGT1A1_R :5' -TGCCAGAGGTTCGCCCTCTCCTACT-3' ；
[0014] 擴(kuò)增EGFRintronl基因的引物對(duì)如下：
[0015] EGFRintronl_F:5' -NED-CCCGGAGACTTTCTTTCTTGGATGT-3' ；
[0016] EGFR intronl_R :5' -CTGTCAAGTGGGTTTATGGTCGGTA-3' ；
[0017] 擴(kuò)增BM基因的引物對(duì)如下：
[0018] BIM_F：5, -6-FAM-GCTAACTCAACAAACCCATCAGAAC-3 ,；
[0019] BM_R :5' -AGCCAGTAAATATAAATCCAAAGCA-3' ；
[0020] (2)多重PCR擴(kuò)增
[0021] 將步驟（1)中的擴(kuò)增引物配成引物混合液，其中各引物的濃度如下：UGT1A1_F 1. 0 y M、UGT1A1_R 1. 0 y M、EGFR intronl_F 2 y M、EGFR intronl_R 2 y M、BM_F 2 y M、 BIM_R 2 y M ;用引物混合液進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；
[0022] (3)毛細(xì)管電泳
[0023] 將上述PCR產(chǎn)物用水作體積比1 :55稀釋，然后取1y1稀釋產(chǎn)物、0. 2y1LIZ120 和9y1甲酰胺混合，按AB3730操作說明上機(jī)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)果用GeneMapper4. 1 分析，判讀結(jié)果；
[0024] (4)判讀結(jié)果
[0025] UGT1A1 :由于PCR引物標(biāo)記上了 VIC熒光，UGT1A1不同的分子分型在毛細(xì)管電泳 圖上產(chǎn)生不同大小的綠色產(chǎn)物峰，單個(gè)124. 2大小的峰為6/6型，單個(gè)128. 4大小的峰為 7/7型，124. 2及126. 4兩個(gè)峰為6/7型（如表1所示）；
[0026] 表1 UGT1A1結(jié)果判讀
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的方法，其特征在于包括如下步 驟： (1) 設(shè)計(jì)擴(kuò)增肺癌三個(gè)相關(guān)基因的擴(kuò)增引物 擴(kuò)增UGT1A1基因的引物對(duì)如下： UGT1A1_F :5' -VIC-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA-3' ； UGT1A1_R:5' -TGCCAGAGGTTCGCCCTCTCCTACT-3' ； 擴(kuò)增EGFR intronl基因的引物對(duì)如下： EGFR intronl_F :5' -NED-CCCGGAGACTTTCTTTCTTGGATGT-3' ； EGFR intronl_R:5' -CTGTCAAGTGGGTTTATGGTCGGTA-3' ； 擴(kuò)增基因的引物對(duì)如下： BM_F :5' -6-FAM-GCTAACTCAACAAACCCATCAGAAC-3' ； BIM_R：5, -AGCCAGTAAATATAAATCCAAAGCA-3,； (2) 多重PCR擴(kuò)增 將步驟（1)中的擴(kuò)增引物配成引物混合液，其中各引物的濃度如下：UGT1A1_F lyM、 UGT1A1_R 1 y M、EGFR intronl_F 2 y M、EGFR intronl_R 2 y M、BM_F 2 y M、BM_R 2 y M ; 用引物混合液進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物； (3) 毛細(xì)管電泳 將上述PCR產(chǎn)物用水作體積比1 :55稀釋，然后取1 y 1稀釋產(chǎn)物、0. 2 y 1 LIZ120和 9 y 1甲酰胺混合，按AB3730操作說明上機(jī)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，電泳結(jié)果用GeneMapper4. 1分 析，判讀結(jié)果； (4) 判讀結(jié)果 UGT1A1 :由于PCR引物標(biāo)記上了 VIC熒光，UGT1A1不同的分子分型在毛細(xì)管電泳圖上 產(chǎn)生不同大小的綠色產(chǎn)物峰，單個(gè)124. 2大小的峰為6/6型，單個(gè)128. 4大小的峰為7/7型， 124. 2及126. 4兩個(gè)峰為6/7型； EGFR intronl :EGFR內(nèi)含子1CA區(qū)的長度約為14?21CA，可分為純合型及雜合型，由 于引物標(biāo)記上NED熒光，在毛細(xì)管電泳圖上197. 1-213. 5位置上可見一個(gè)或兩個(gè)黑色的峰； 峰的大小不同表示CA的長度不一樣；單個(gè)峰為純合型，兩個(gè)峰為雜合型； BM :若在毛細(xì)管電泳圖上的263. 6位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色峰，為缺失型；未出現(xiàn)峰則為野生型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的方法，其特 征在于：步驟（2)中所述的多重PCR擴(kuò)增的條件為：95°C 5min ;95°C 20sec、58°C 30sec、 72°C 60sec，40 個(gè)循環(huán)；72°C 3min。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的方法，其特 征在于：步驟⑵中所述的多重PCR擴(kuò)增的體系為：Qiagene Multiplex PCR master mix 5 y 1、擴(kuò)增引物混合液1 y 1、DNA模板10ng，雙蒸水補(bǔ)至10 y 1。
4. 一種檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，為依據(jù)權(quán)利要求1? 3任一項(xiàng)所述的方法設(shè)計(jì)得到，其特征在于包含如下引物： UGT1A1_F :5' -VIC-CTCCCTGCTACCTTTGTGGACTGA-3' ； UGT1A1_R:5' -TGCCAGAGGTTCGCCCTCTCCTACT-3' ； EGFR intronl_F :5' -NED-CCCGGAGACTTTCTTTCTTGGATGT-3' ； EGFR intronl_R:5' -CTGTCAAGTGGGTTTATGGTCGGTA-3' ； BM_F :5' -6-FAM-GCTAACTCAACAAACCCATCAGAAC-3' ； BM_R :5' -AGCCAGTAAATATAAATCCAAAGCA-3'。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，其 特征在于：包含權(quán)利要求4中所述的引物制備得到的引物混合液，其中各引物的濃度如 下：UGT1A1_F lyM、UGTlAl_R lyM、EGFR intronl_F 2yM、EGFR intronl_R 2yM、BM_F 2 yM、BM_R 2 yM〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測肺癌治療耐藥及毒副作用相關(guān)基因多態(tài)性的試劑盒，其特 征在于：還包含 Qiagene Multiplex PCR master mix。
7. 權(quán)利要求4?6任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450924SQ201410784570
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】吳一龍, 蘇健, 張緒超, 楊衿記, 鐘文昭 申請(qǐng)人:廣東省人民醫(yī)院