一種新化合物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新化合物的制備方法，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法利用一種從浙江杭州臨安天目山采集的土樣中分離篩選出的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D，經(jīng)過(guò)菌種的活化培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液，按常規(guī)化學(xué)方法提取、層析，分離純化獲得活性化合物四霉素P (Tetramycin P)，該化合物為新的四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，并可抑制黃瓜立枯病菌和番茄灰霉病菌等作物病原真菌的生長(zhǎng)，抑制效果較常規(guī)化學(xué)藥劑強(qiáng)。
CGMCC No. 2060
20070525
【專利說(shuō)明】一種新化合物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及新化合物四霉素P的制備方法及其對(duì)植 物病原真菌的抑制作用。

【背景技術(shù)】
[0002] 由不同病原菌引起的作物病害中，約有70%的病害是由真菌引起的。多烯大環(huán)內(nèi) 酯類抗生素是一類具有多個(gè)共軛雙鍵的抗生素，其紫外吸收呈指狀，特征非常明顯。根據(jù)共 軛雙鍵的數(shù)目，多烯類抗生素可分為三烯、四烯、五烯、六烯、七烯等5類，通常具有很強(qiáng)的 抗真菌活性，且抗真菌譜廣，對(duì)作物主要病原真菌如黃瓜立枯病菌so/afli)、 番前灰霉病菌ciflerea)、番前早疫病菌so/afli)、小麥赤霉病菌 和黃瓜枯萎病菌（Z7. ;對(duì)糧食和飼料中常見(jiàn)的霉菌 如黃曲霉〇^5/76?/足/#^5 /yaras)、赫曲霉（A ocAracc^s)和黑曲霉（A fliger)，以及釀酒 酵母等均有活性。據(jù)報(bào)道該類抗生素目前主要在醫(yī)藥上應(yīng)用 較多，若以多烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物為主要活性成分開(kāi)發(fā)成廣譜抗真菌生物制劑，將為農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)提供良好的生防材料。
[0003] 目前對(duì)植物病害的防治，主要采用化學(xué)農(nóng)藥殺滅病原菌，但化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人畜的毒 副作用和殘留問(wèn)題至今仍難以有效的解決。利用放線菌產(chǎn)生的抗病原真菌的活性物質(zhì)進(jìn)行 植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研宄、便于生產(chǎn)、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從杭州的土壤中分離到一株生防放線菌，并對(duì)此生防放線菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物 中的抗菌成分進(jìn)行分離，得到了主要活性成分，經(jīng)四大光譜分析，明確了其結(jié)構(gòu)式。該發(fā)明 為微生物農(nóng)藥的進(jìn)一步研制和開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株和生物活性化合物。
[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)化學(xué)農(nóng)藥不安全與微生物農(nóng)藥種類較少的不足，提供一種新 的抗植物病原真菌活性化合物；本發(fā)明的另一目的是提供該活性化合物在植物病害上的防 治作用。
[0006] 本發(fā)明淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌的分離、篩選與鑒定： 是于2006年8月在浙江杭州臨安天目山采集的土樣中，經(jīng)分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測(cè) 定以及對(duì)抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟獲得并保存；經(jīng)微生物分類學(xué)鑒 定為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（t/iastetocAroffiogefles)，定名為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌 (51 (ocAroffiogefles) D。該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心保藏，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2007年5月25日，保藏登 記號(hào) CGMCCNo. 2060。
[0007] 淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D顯微形態(tài)特征：孢子絲直、鉤狀、松散螺旋形，孢子長(zhǎng)圓、橢圓 或卵圓形。
[0008] 本發(fā)明所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D，經(jīng)發(fā)酵提取可獲得對(duì)部分植物真菌病害病原 菌具有抑制作用的活性化合物，該化合物的化學(xué)名稱為（7忍124 13忍15忍17忍19萬(wàn) )-21-((4-amin〇-3, 5-dihydroxy _6_ methyltetrahydr〇-2^-pyran -2-yl) oxy -12 -ethylidene -1，5,6,25 - tetrahydroxy -11- methyl-9 -〇xo_10,27 - dioxabicyclo [21. 3. 1] heptacosa-7, 13, 15, 17, 19-pentaene-24_carboxylic acid，是一種新的四 烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物，已有文獻(xiàn)中未見(jiàn)有報(bào)道，中文名稱命名為四霉素P，英文名稱為 Tetramycin P〇
[0009] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種新化合物的制備方法，按以下步驟進(jìn)行： (1) 菌種的活化培養(yǎng)：將分離保存的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D菌種移至試管內(nèi)高氏一號(hào)斜 面上，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)至試管斜面長(zhǎng)滿孢子； (2) 發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000 mL中含有可溶性淀粉20 g，黃豆粉40 g，NH4C1 3 g，CaC03 5 g，MgS04 2 g，滅菌，待冷卻至50 °C，在無(wú)菌條件下接種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D 至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28°C ±1°C條件下，培養(yǎng)5天； (3) 發(fā)酵物提?。喊l(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，按常規(guī)化學(xué)方法提取、層析，分離純化獲得活 性化合物Tetramycin P，該化合物分子式為C35H51013N，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)下式；

【權(quán)利要求】
1. 一種新化合物的制備方法，包括如下步驟：淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D經(jīng)斜面活化培養(yǎng)、發(fā) 酵培養(yǎng)獲得含有四霉素P的發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇 萃取，取上層，在真空條件下濃縮至浸膏，該浸膏再用甲醇溶解，離心取上清液，而后上ODS 柱，以甲醇和水(體積比1〇%~90%)洗脫，進(jìn)一步分離純化得活性化合物Tetramycin P(四霉 素P)，所述的淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的保藏登記號(hào)為CGMCC No.2060,四霉素P結(jié)構(gòu)式為：
四霉素P是一種新的四烯大環(huán)內(nèi)酯類化合物。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的菌種D斜面活化培養(yǎng)步驟為：斜面培養(yǎng) 基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基，其組分與含量為：K2HP040. 5g、KN03lg、MgSO4O. 5g、可溶性淀粉20g、 NaCl0. 5g、FeSO4O.Olg、瓊脂20g，溶化后補(bǔ)足水至IL;在無(wú)菌條件下用接種環(huán)挑取少許淀 粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D的孢子，至已滅菌的高氏一號(hào)培養(yǎng)基試管中，置培養(yǎng)箱內(nèi)在28°C±1°C條 件下活化培養(yǎng)96 h，至試管斜面長(zhǎng)滿孢子。
3. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)為：發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中 含有可溶性淀粉20g，黃豆粉40g，NH4Cl3g，CaC03 5g，MgS04 2g;滅菌，待冷卻至50°C 在無(wú)菌條件下接種淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌D至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28°C±1°C條件下，培養(yǎng)5天。
【文檔編號(hào)】C12R1/525GK104450835SQ201410785316
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】申屠旭萍, 俞曉平, 劉楠楠, 郝培應(yīng), 王正亮, 許益鵬, 劉光富 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院