一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)n-乙酰氨基葡萄糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟：步驟1，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶；步驟2，粗酶液的獲得；步驟3，濃縮酶液；步驟4，生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖。本發(fā)明首次提出一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，該方法中產(chǎn)酶培養(yǎng)基成本低廉，生產(chǎn)周期短；濃縮酶液所用材料可重復(fù)再利用，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，酶活回收率高；降解過(guò)程中采取了防止染菌措施，實(shí)現(xiàn)了以低價(jià)值的幾丁質(zhì)為原料高效率迅速生產(chǎn)具有高醫(yī)療價(jià)值N-乙酰氨基葡萄糖的目的，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【專利說(shuō)明】一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003]甲殼素(C8H13O5N)n，又名幾丁質(zhì)、甲殼質(zhì)或殼多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖通過(guò)糖苷鍵結(jié)合起來(lái)的聚合物，是一種含氮多糖類物質(zhì)，為蝦、蟹、昆蟲(chóng)等甲殼的重要成分。分子結(jié)構(gòu)為長(zhǎng)鏈狀，由8000個(gè)單體組成的多糖，為自然界的一種半透明而堅(jiān)固的材料。幾丁質(zhì)能通過(guò)化學(xué)法和生物酶法被降解成幾丁寡糖及單糖，目前常用的化學(xué)降解法具有環(huán)境污染巨大、反應(yīng)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量差、過(guò)程不易控制等缺點(diǎn)，已逐步被生物酶法降解幾丁質(zhì)取代。
[0004]N-乙酰氨基葡萄糖是殼多糖保健食品系列中最新的第三代保健機(jī)能性食品添加齊U，可作低熱量的甜味劑，也可作為抗癌、防癌、降血脂、降血壓的食品添加劑。主要用于臨床增強(qiáng)人體免疫系統(tǒng)的功能，抑制癌細(xì)胞或纖維細(xì)胞的過(guò)度生長(zhǎng)，對(duì)癌癥和惡性腫癌能起到抑制和治療作用，此外，N-乙酰氨基葡萄糖對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)疼痛也有治療作用。
[0005]目前報(bào)道的微生物發(fā)酵所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酶活普遍較低，在降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖時(shí)轉(zhuǎn)化效率低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。因此對(duì)酶液進(jìn)行濃縮，提高降解效率是很有必要的。傳統(tǒng)酶濃縮方法包括鹽沉，反滲透等方法，存在諸多問(wèn)題:鹽沉過(guò)程酶活損失大，操作繁瑣；凝膠吸附法成本高昂，難以推廣。此外，幾丁質(zhì)降解產(chǎn)物既可以作為菌體利用的碳源又可作為氮源，轉(zhuǎn)化過(guò)程難以控制，極易染菌。
[0006]


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，通過(guò)調(diào)控優(yōu)化微生物產(chǎn)酶、對(duì)酶液進(jìn)行濃縮，轉(zhuǎn)化過(guò)程中采取抑菌措施，進(jìn)而能高效、安全的降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)幾丁寡糖產(chǎn)品。
[0008]為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟:
步驟I，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶
選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株作為種子，在37°C、200 rpm下培養(yǎng)得種子液，再以體積分?jǐn)?shù)5°/Γ?Ο%接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，裝液量40-60%，培養(yǎng)溫度24°C ^37°C，轉(zhuǎn)速為200?500 rpm,通氣量lvvnT3vvm，初始ρΗ7.0?8.0,發(fā)酵72?96h后收集發(fā)酵液；
步驟2，粗酶液的獲得
將步驟I獲得的發(fā)酵液低溫高速離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質(zhì)酶粗酶液，低溫貯存，備用；
步驟3，濃縮酶液
將步驟2中所得得到的幾丁質(zhì)粗酶液，低溫透析濃縮得到濃縮酶液，測(cè)粗酶液和濃縮酶液酶活，計(jì)算回收率；
步驟4，生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖
利用步驟3中獲得的濃縮酶液無(wú)菌轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)，其中，轉(zhuǎn)化體系的溫度為25-37°C，攪拌速度為200 rpm，轉(zhuǎn)化24-72 h，液相法檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖濃度。
[0009]作為優(yōu)選的是，所述產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株為Chi tinolyti cbac ter meiyuanensi sSYBC-Hl (CGMCC NO:3438 ；ATCC BAA-2140)或知ciersp.GC72 (CCTCC NO:M2014113)。
[0010]作為優(yōu)選的是，步驟3，濃縮用變色硅膠或無(wú)色硅膠與變色硅膠的混合物。
[0011]作為優(yōu)選的是，步驟3，濃縮溫度為4°C，濃縮時(shí)間2_12h。
[0012]作為優(yōu)選的是，步驟4，還包括占轉(zhuǎn)化體系體積分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抗生素，所述所述抗生素為卡納或四環(huán)素。
[0013]測(cè)酶活所用方法為DNS法:將1.9 mL 0.05mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)和0.5HiL 1%的膠體幾丁質(zhì)加100 μ I酶液組成的反應(yīng)體系，37°C水浴30 min，沸水浴5 min中止反應(yīng)，加入2 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫，離心后取上清液，在波長(zhǎng)535 nm下測(cè)吸光度，以滅活的等量酶液作空白對(duì)照。
[0014]有益效果
(I)利用硅膠及透析袋濃縮幾丁質(zhì)酶液，較傳統(tǒng)濃縮酶液的方法具有操作簡(jiǎn)單，成本低，高酶活回收率的優(yōu)勢(shì)。硅膠吸水快，能很直觀看到吸水情況，節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間，不需要外界能量輔助，且能重復(fù)利用。
[0015](2)采用高濃度酶液生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖效率高，快速，大大降低了生產(chǎn)成本。
[0016](3)采用往轉(zhuǎn)化體系中加入適量抗生素，可有效地防止染菌，降低了安全隱患。
[0017](4)轉(zhuǎn)化體系是經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率高。
[0018]

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面的實(shí)施例可使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0020]實(shí)施例1
步驟I，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶免 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl 菌株作為種子，接種到培養(yǎng)基(2g/L 葡萄糖，2 g/L 蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4,0.3 g/L K2HPO4.3Η20，0.4 g/LMgS04.7H20，pH
7.0)上，37°C、200rpm下培養(yǎng)12 h，再以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(3g/L 粉粒幾丁質(zhì)，3 g/L 菊芋粉，3 g/L 尿素，0.7 g/L KH2PO4,0.3 g/L K2HPO4.3H20，0.5g/LMgS04.7H20)的7.5 L發(fā)酵罐，裝液量4.5L，在溫度為26°C，轉(zhuǎn)速為250rpm，通氣量為Ivvm,初始ρΗ7.5下發(fā)酵72 h后收集發(fā)酵液。
[0021]步驟2，粗酶液的獲得
將步驟I獲得的發(fā)酵液在4°C離心機(jī)中SOOOg離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質(zhì)酶粗酶液，4°C貯存，備用；
步驟3，濃縮酶液將步驟2中所得到的幾丁質(zhì)酶粗酶液，裝入透析袋后，埋入干燥劑硅膠中放入4°C冰箱，當(dāng)硅膠顏色從藍(lán)色變成紅色變化，重新?lián)Q成干燥的硅膠，濃縮12h，經(jīng)過(guò)測(cè)量濃縮后體積，得0.5倍體積分?jǐn)?shù)濃縮酶液。用DNS法測(cè)粗酶液為0.70U/mL和濃縮酶液酶活為1.3 U/mL，幾丁質(zhì)酶活回收率為93%。
[0022]步驟4，生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖
利用步驟3中獲得的濃縮酶液無(wú)菌轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)，其中，轉(zhuǎn)化體系(40 g/L粉粒幾丁質(zhì)、10ml濃縮的幾丁質(zhì)酶液、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的四環(huán)素)100 mL,在溫度37°C，200 rpm下攪拌轉(zhuǎn)化24 h。液相測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖濃度為35 g/L，產(chǎn)率87.5%。
[0023]實(shí)施例2
步驟I，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶免 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl 菌株作為種子，接種到培養(yǎng)基(4g/L 葡萄糖，4 g/L 蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4,0.3 g/L K2HPO4.3Η20，0.5 g/LMgS04.7H20，pH
7.0)上，37°C、200rpm下培養(yǎng)12 h，再以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(4 g/L粉粒幾丁質(zhì)，4 g/L菊芋粉4 g/L，尿素0.7 g/LKH2P04,0.3 g/L K2HPO4.3Η20，0.5 g/LMgSO4.7H20)的7.5L發(fā)酵罐，裝液量4.5L，在溫度26°C，轉(zhuǎn)速為250 rpm,通氣量為2vvm，初始pH7.5下發(fā)酵72 h后發(fā)酵收集發(fā)酵液。
[0024]步驟2，粗酶液的獲得
將步驟I獲得的發(fā)酵液在4°C離心機(jī)中SOOOg離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質(zhì)酶粗酶液，4°C貯存，備用。
[0025]步驟3，濃縮酶液
將步驟2中所得到的幾丁質(zhì)酶粗酶液，裝入透析袋后，埋入干燥劑硅膠中放入4°C冰箱，當(dāng)硅膠顏色從藍(lán)色變成紅色變化，重新?lián)Q成干燥的硅膠，濃縮5h經(jīng)過(guò)測(cè)量濃縮后體積，得2/3倍體積分?jǐn)?shù)濃縮酶液。用DNS法測(cè)粗酶液為0.79 U/mL和濃縮酶液酶活為1.35 U/mL，幾丁質(zhì)酶活回收率為85.2%。
[0026]步驟4，生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖
利用步驟3中獲得的濃縮酶液無(wú)菌轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)，其中，轉(zhuǎn)化體系(40 g/L粉粒幾丁質(zhì)、200 mL濃縮的幾丁質(zhì)酶液、體積分?jǐn)?shù)為0.15%四環(huán)素)200 mL，在溫度37°C，200 rpm下攪拌轉(zhuǎn)化24 h。液相測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖濃度為36.5g/L，產(chǎn)率91.3%。
[0027]實(shí)施例3
步驟I，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶免 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl 菌株作為種子，接種到培養(yǎng)基(4g/L 葡萄糖，4 g/L 蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4,0.3 g/L K2HPO4.3Η20，0.5 g/LMgS04.7H20，pH
7.0)上，37°C、200rpm下培養(yǎng)12 h，再以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(4 g/L 粉粒幾丁質(zhì)，4 g/L 菊芋粉 4 g/L，尿素 0.7 g/LKH2P04，0.3 g/L K2HPO4.3H20，0.5g/LMgS04.7H20)的7.5L發(fā)酵罐，裝液量4.5L，在溫度為26°C，轉(zhuǎn)速為250 rpm，通氣量為2vvm，初始ρΗ7.5下發(fā)酵72 h后收集發(fā)酵液。
[0028]步驟2，粗酶液的獲得
將步驟I獲得的發(fā)酵液在4°C離心機(jī)中SOOOg離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質(zhì)酶粗酶液，4°C貯存，備用。
[0029]步驟3，濃縮酶液
將步驟2中所得到的幾丁質(zhì)酶粗酶液，裝入透析袋中，埋入干燥劑硅膠中放入4°C低溫恒溫?fù)u床，當(dāng)硅膠顏色從藍(lán)色變成紅色變化，重新?lián)Q成干燥的硅膠，濃縮12h經(jīng)過(guò)測(cè)量濃縮后體積，得1/3倍體積分?jǐn)?shù)濃縮酶液。用DNS法測(cè)粗酶液為0.78 U/mL和濃縮酶液酶活為2.12 U/mL，幾丁質(zhì)酶活回收率為90.5%。
[0030]步驟4，生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖
利用步驟3中獲得的濃縮酶液無(wú)菌轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)，其中，轉(zhuǎn)化體系(40 g/L粉粒幾丁質(zhì)、200mL濃縮的幾丁質(zhì)酶液、體積分?jǐn)?shù)為0.1%卡納和體積分?jǐn)?shù)為0.1%四環(huán)素)200 mL，在溫度37°C，200 rpm下攪拌轉(zhuǎn)化24 h。液相測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖濃度為39 g/L,產(chǎn)率97.5%。
[0031]對(duì)比例
步驟I，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶免 Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl 菌株作為種子，接種到培養(yǎng)基(4g/L 葡萄糖，4 g/L 蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4,0.3 g/L K2HPO4.3Η20，0.5 g/LMgS04.7H20，pH
7.0)上，37°C、200 rpm下培養(yǎng)12 h，再以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基(4 g/L 粉粒幾丁質(zhì)，4 g/L 菊芋粉 4 g/L 尿素 0.7 g/LKH2P04,0.3 g/L K2HPO4.3Η20，0.5 g/LMgSO4.7Η20)的7.5L發(fā)酵罐，裝液量4.5L，在溫度為26°C，轉(zhuǎn)速為250 rpm,通氣量為2vvm，初始pH7.5下發(fā)酵72h后收集發(fā)酵液。
[0032]步驟2，粗酶液的獲得
將步驟I獲得的的發(fā)酵液在4°C離心機(jī)中SOOOg離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質(zhì)酶粗酶液，4°C貯存，備用。
[0033]步驟3，生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖
利用步驟2中粗酶液無(wú)菌轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)，其中，轉(zhuǎn)化體系(40 g/L粉粒幾丁質(zhì)、200mL幾丁質(zhì)粗酶液、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的卡納和體積分?jǐn)?shù)為0.1%的四環(huán)素)200 mL，在溫度37°C，200rpm下攪拌轉(zhuǎn)化24 h。液相測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖濃度為19 g/L，產(chǎn)率47.5%。
[0034]通過(guò)實(shí)施例1-3和對(duì)比例的結(jié)果可知，本發(fā)明的方法生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖濃度高，產(chǎn)率高，其中在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，酶液的濃縮倍數(shù)從不濃縮到濃縮3倍時(shí)，N-乙酰氨基葡萄糖濃度從19g/L變成39g/L，產(chǎn)率從47.5%變?yōu)?7.5%。
【權(quán)利要求】
1.一種酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I，微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶 選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株作為種子，在37°C、200 rpm下培養(yǎng)得種子液，再以體積分?jǐn)?shù)59TlO%接種量接入裝有產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，裝液量40?60%，培養(yǎng)溫度24°C?37°C，轉(zhuǎn)速為200?500 rpm,通氣量lvvnT3vvm，初始ρΗ7.0?8.0,發(fā)酵72?96h后收集發(fā)酵液； 步驟2，粗酶液的獲得 將步驟I獲得的發(fā)酵液低溫高速離心，分離菌體，收集上清液，得到幾丁質(zhì)酶粗酶液，低溫貯存，備用； 步驟3，濃縮酶液 將步驟2中所得到的幾丁質(zhì)酶粗酶液，低溫透析濃縮得到濃縮酶液，測(cè)粗酶液和濃縮酶液酶活，計(jì)算回收率； 步驟4，生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖 利用步驟3中獲得的濃縮酶液無(wú)菌轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)，其中，轉(zhuǎn)化體系的溫度為25-37°C，攪拌速度為200 rpm，轉(zhuǎn)化24-72 h，液相法檢測(cè)N-乙酰氨基葡萄糖濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于:所述產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株為Chi tinolyti cbac ter meiyuanensis SYBC-Hl或Chitinibactersp.GC72。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于:步驟3，濃縮用變色硅膠或無(wú)色硅膠與變色硅膠的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于:步驟3，濃縮溫度為4°C，濃縮時(shí)間2-12h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于:步驟4,還包括占轉(zhuǎn)化體系體積分?jǐn)?shù)為0.1-0.2%的抗生素,所述所述抗生素為卡納或四環(huán)素。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104388496SQ201410785604
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】陳可泉, 張阿磊, 高聰, 何珣, 歐陽(yáng)平凱 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)