抗大菱鲆血清免疫球蛋白m的單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，所述的單克隆抗體是由名稱為：雜交瘤細(xì)胞株Sm-IgM，保藏單位為：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏號(hào)為：CCTCC NO: C2014158，保藏日期為：2014年9月2日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。本發(fā)明所制備的抗大菱鲆免疫球蛋白M的單克隆抗體，可用于大菱鲆血清中免疫球蛋白M水平及淋巴細(xì)胞的檢測(cè)，為大菱鲆免疫系統(tǒng)的研究以及免疫應(yīng)答動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)提供有力工具。
CCTCC NO：C2014158
20140902
【專利說明】抗大菱鲆血清免疫球蛋白IV！的單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，具體涉及一種抗大菱鲆
1113^1111118)血清免疫球蛋白1的單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，屬于魚類分子免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]免疫球蛋白是魚類體液特異性免疫應(yīng)答中最主要的效應(yīng)分子，免疫球蛋白1是魚類中最早被發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白，也是硬骨魚類血清中含量最高的免疫球蛋白，在執(zhí)行體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮著最主要作用。經(jīng)過抗原刺激后，魚體可迅速產(chǎn)生產(chǎn)特異性的免疫球蛋白I抗體，分泌于魚類血液和粘液等液體中，具有抗菌、抗病毒、中和毒素的免疫活性，也可以介導(dǎo)凝集作用和調(diào)理作用。另外膜結(jié)合型免疫球蛋白1分布于成熟8淋巴細(xì)胞表面，可以作為膜表面抗原受體，是8細(xì)胞識(shí)別識(shí)別抗原的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。單克隆抗體由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，成為研宄魚類免疫球蛋白的重要工具。因此，制備抗大菱鲆免疫球蛋白1的單克隆抗體，可用于大菱鲆血清中免疫球蛋白1水平及淋巴細(xì)胞的檢測(cè)，為大菱鲆免疫系統(tǒng)及免疫應(yīng)答動(dòng)態(tài)等研宄提供有力工具。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一是提供一種由雜交瘤細(xì)胞分泌的抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體。
[0004]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單克隆抗體的制備方法與應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為:雜交瘤細(xì)胞株&11-1挪，保藏單位為:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏號(hào)為勵(lì):02014158，保藏日期為:2014年9月2日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。
[0006]在倒置顯微鏡下觀察，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的該雜交瘤細(xì)胞分裂旺盛、外觀飽滿、渾圓、折光性強(qiáng)、細(xì)胞大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細(xì)胞有無限分裂增生能力；長(zhǎng)勢(shì)良好的該雜交瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)2-3天，其培養(yǎng)基由桃紅色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，其中含有該雜交瘤細(xì)胞分泌的大量抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體。
[0007]一種所述抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟:將大菱鲆血清經(jīng)鹽析結(jié)合柱層析法純化得到大菱鲆血清免疫球蛋白1 ；以純化的大菱鲆血清免疫球蛋白1為抗原免疫8八18八小鼠；融合被免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞；經(jīng)免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法，篩選出分泌抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞&11-181，其分泌的抗體即為抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體。
[0008]所述的鹽析結(jié)合柱層析法，是將大菱鮮血清經(jīng)飽和硫酸錢分步鹽析后，經(jīng)111--)⑧？1~01:6111八親和層析柱進(jìn)一步純化得到大菱鮮血清免疫球蛋白1。
[0009]所述的免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法是間接酶聯(lián)免疫法、間接免疫熒光法和轉(zhuǎn)印免疫印跡法；其中所述的間接酶聯(lián)免疫法是將細(xì)胞融合后所得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與純化的大菱鲆血清免疫球蛋白1于96孔酶標(biāo)板中反應(yīng)；繼而加入辣根過氧化物酶(八?)標(biāo)記的羊抗鼠抗體；405 11111工作波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，篩選抗大菱鲆免疫球蛋白1的單克隆抗體。所述的免疫熒光法是雜交瘤細(xì)胞&11-181分泌的單克隆抗體與大菱鲆外周血白細(xì)胞懸液于培養(yǎng)板孔中反應(yīng)；繼而加入異硫氰熒光素斤110標(biāo)記的羊抗鼠抗體；取部分細(xì)胞滴于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察，確定該單抗可與淋巴細(xì)胞膜表面免疫球蛋白1發(fā)生特異性結(jié)合。所述的轉(zhuǎn)印免疫印跡法是將雜交瘤細(xì)胞&11-181分泌的抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜的大菱鮮血清免疫球蛋白1反應(yīng)，確定該單抗的抗原決定簇位于分子量為78的大菱鲆免疫球蛋白1的重鏈上。
[0010]所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體的應(yīng)用為:利用此13八方法檢測(cè)經(jīng)滅活愛德華細(xì)菌免疫后大菱鲆外周血中特異性抗體水平的變化；利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血白細(xì)胞中表面免疫球蛋白1陽性淋巴細(xì)胞比例。
[0011]本發(fā)明的制備技術(shù)路線設(shè)計(jì)新穎，其通過飽和硫酸錢分步鹽析結(jié)合111--)⑧
八親和層析柱純化得到高純度的大菱鲆血清免疫球蛋白1作為抗原免疫8從8/(3小鼠；經(jīng)細(xì)胞融合、免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法篩選得到抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體；利用所得的單克隆抗體再經(jīng)免疫熒光法驗(yàn)證其特性；利用所得的單抗應(yīng)用于間接酶聯(lián)免疫法，檢測(cè)經(jīng)愛德華免疫后魚體血清中的特異性抗體水平，利用所得的單抗應(yīng)用于流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)大菱鲆外周血，脾和前腎的白細(xì)胞中表面免疫球蛋白1陽性淋巴細(xì)胞比例。這樣的制備技術(shù)路線嚴(yán)密合理且可行，充分發(fā)揮了現(xiàn)有免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法的作用和效果。本發(fā)明所制備的抗大菱鲆免疫球蛋白1的單克隆抗體，可用于大菱鲆血清中免疫球蛋白1水平及淋巴細(xì)胞的檢測(cè)，為大菱鲆免疫系統(tǒng)的研宄以及免疫應(yīng)答動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)提供有力工具。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明的抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單抗的間接酶聯(lián)免疫反應(yīng)結(jié)果圖。
[0013]圖2為本發(fā)明的抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單抗的轉(zhuǎn)印免疫印跡結(jié)果圖。
[0014]圖3為本發(fā)明的抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單抗的間接免疫熒光結(jié)果圖。
[0015]圖4為本發(fā)明的抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單抗檢測(cè)特異性抗體水平變化結(jié)果圖。
[0016]圖5為本發(fā)明的抗大菱鲆血清免疫球蛋白1單抗的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面免疫球蛋白1陽性淋巴細(xì)胞比例結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0018]實(shí)施例1:抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體的制備。
[0019]一、抗原的制備
大菱鲆血清免疫球蛋白1的純化
①大菱鲆的免疫:在35。條件下，用普通牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)愛德華細(xì)菌40匕無菌？83清洗后，以福爾馬林滅活(0.5% ^八)；以滅活愛德華細(xì)菌(1^108 (36118/1111)與弗氏不完全佐劑等體積混勻，腹腔注射免疫健康大菱鲆，每尾注射100 V 1。
[0020]②飽和硫酸銨鹽析:免疫后35天取大菱鲆血清，緩慢加入1)? 7.0的飽和硫酸銨溶液，使其終濃度達(dá)50%，4。靜置過夜，15 000 8離心30 ―!!，沉淀溶解于0.02 001/1磷酸鈉緩沖液(13? 7.0),加入透析袋中，再用相同的緩沖液透析24 11，每4卜換液一次，獲得的粗提物。
[0021]③!11--) ？1~01:6111八親和層析:將上述②中提取物通過!11--) ？1~01:6111八親和層析柱進(jìn)一步純化，收集洗脫峰，透析，凍干濃縮，重懸于0.01 11101/1的？83(1)? 7.4)中，調(diào)整蛋白含量為11118加1。
[0022]二、免疫小鼠
用提純的大菱鲆血清免疫球蛋白1作為抗原。每次的免疫劑量為0.1 “，免疫共分4次進(jìn)行，前2次免疫間隔為2周，腹腔注射；后3次免疫間隔為1周，尾靜脈注射。
[0023](1)基礎(chǔ)免疫:提純的大菱鲆血清免疫球蛋白1與弗氏完全佐劑等量(乂八)混勻作為抗原；
(2)加強(qiáng)免疫:提純的大菱鲆血清免疫球蛋白1與弗氏不完全佐劑等量⑶八)混勻作為抗原；
(3)二次加強(qiáng)免疫:提純的大菱鲆血清免疫球蛋白1作為抗原；
(4)融合前三天的擴(kuò)增免疫:提純的大菱鲆血清免疫球蛋白1作為抗原。
[0024]三、細(xì)胞融合
(1)脫頸椎處死免疫小鼠，無菌取出脾臟和胸腺后，分別過100目網(wǎng)篩，用1？？11-1640溶液吹打形成單細(xì)胞懸液；
(2)分別將脾細(xì)胞懸液和胸腺細(xì)胞懸液1000印!!!離心3111111，棄去上清液，脾細(xì)胞沉淀用尺?11-1640溶液重懸，胸腺細(xì)胞沉淀用含有1%撤I的1？？11-1640 (含10%胎牛血清)選擇性細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。
[0025](3)取3父107個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的？3463-仏8譏骨髓瘤細(xì)胞，1000印111離心30111，去上清液后，用1？？11-1640溶液重懸；
(4)將脾細(xì)胞懸液與瘤細(xì)胞懸液混合均勻后，1000印111離心3111111，完全吸去上清液，輕彈離心管底，使兩種細(xì)胞沉淀充分混勻成糊狀；用吸管吸取預(yù)溫到37。(:的聚乙二醇溶液1 “，滴加到離心管內(nèi)，在1 111111內(nèi)加完；然后在37。(:水浴靜置5 111111 ；
(5)繼續(xù)滴加已經(jīng)預(yù)溫到37。(:的1？？11-1640溶液15“，使稀釋而失去作用；
(6)補(bǔ)加尺?11-1640溶液至401111，經(jīng)1000印!]!離心3 111111，棄去上清液；
(7)將沉淀的細(xì)胞用3“ 37。的1？？11-1640 (含10%胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，凍存201 ；
(8)將剩下的1“細(xì)胞懸液加入(2)制成的胸腺細(xì)胞懸液，混合均勻后滴加到96孔培養(yǎng)板中；
(9)將培養(yǎng)板放入37。0，(?濃度為4.5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，大約兩周后，取雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)。
[0026]四、篩選和克隆
(1)篩選:融合后，待雜交瘤細(xì)胞群長(zhǎng)到96孔培養(yǎng)板的孔底面積1/3時(shí)開始檢測(cè)，采用間接酶聯(lián)免疫技術(shù)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞。
[0027]①包被抗原:將提純的大菱鲆血清免疫球蛋白1(1加入96孔酶標(biāo)板中(100沿/孔)，‘。包被過夜；
②吸出包被液，用含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液0831)洗滌，每次5 111111，洗三次；
③每孔加入200沿3%的牛血清白蛋白$83配)，37。封閉1匕；
④同②法洗滌二次；
⑤將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔100沿加入至酶標(biāo)板，37。溫箱孵育1匕；
⑥同②法洗滌二次；
⑦堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠18(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50沿加入至酶標(biāo)板，37。溫箱孵育1匕；
⑧同②法洗滌三次；然后每孔加入100耵4-硝基酚磷酸鹽㈧冊(cè)？)應(yīng)用液，暗處反應(yīng)5-20 111111，每孔加入50耵21的恥0！1，穩(wěn)定3 — 5 “!！即可用405咖工作波長(zhǎng)測(cè)定00值。
[0028]測(cè)波長(zhǎng)為405鹽時(shí)各孔光吸收值，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)孔與陰性對(duì)照光吸收值之比(戶/ 當(dāng)彡2.1時(shí)該孔為陽性。
[0029](2)克隆:采用有限稀釋法對(duì)檢測(cè)出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆，步驟如下:
①脫頸椎處死小鼠，無菌取出胸腺，在100目網(wǎng)篩上研磨，用1？？11-1640溶液吹打形成單細(xì)胞懸液；
②把胸腺細(xì)胞懸液10001-1)111離心3 111111,棄去上清液，胸腺細(xì)胞沉淀用10 1111尺?11-1640 (含10%胎牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液重懸；
③把要克隆的陽性細(xì)胞孔中的細(xì)胞用血球記數(shù)板記數(shù)，然后用培養(yǎng)液以10倍梯度稀釋，取出100個(gè)雜交瘤細(xì)胞，放入胸腺細(xì)胞懸液中；
④細(xì)胞懸液用滴管吹打均勻，滴加到96孔培養(yǎng)板中，每孔100沿，平均每個(gè)孔含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞；
⑤放入(?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
⑥兩周后通過間接酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測(cè)各孔雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，把所得陽性克隆孔的雜交瘤細(xì)胞按上述方法再克隆一次，以保證形成單克隆。
[0030]五、凍存
取生長(zhǎng)旺盛，形態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，200 8離心5 111111，去上清，加凍存液(9份1？？11-1640培養(yǎng)基+ 1份二甲亞砜),使最終細(xì)胞密度為5父106個(gè)加1，將1 “細(xì)胞懸液裝于2 “凍存管中，擰緊螺蓋，然后將凍存管裝入盛有棉花的小盒內(nèi)，放于-80。超低溫冰箱內(nèi)過夜(8-12 10后，再浸入液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存。本發(fā)明獲得了外觀飽滿，渾圓透亮，分裂旺盛的雜交瘤細(xì)胞，其名稱為:雜交瘤細(xì)胞株&11-181，保藏號(hào)為勵(lì):02014158,保藏單位為:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為:2014年9月2日。
[0031]實(shí)施例2:本發(fā)明單克隆抗體的間接酶聯(lián)免疫法鑒定。
[0032](1)包被抗原:將提純的大菱鲆血清免疫球蛋白1(1 V ^1)加入96孔酶標(biāo)板中(100沿/孔)，‘。包被過夜； (2)吸出包被液，用？831洗滌，每次5111111,洗3次；
(3)每孔加入200耵3%的牛血清白蛋白$83配)37。0封閉1匕；
(4)同②法洗滌3次；
(5)將上述篩選和克隆出的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔50沿加入至酶標(biāo)板，37。溫箱孵育1 11 ；
(6)同②法洗滌3次；
(7)堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔50沿加入至酶標(biāo)板，37。溫箱孵育1匕；
(8)同②法洗滌3次；然后每孔加入100耵應(yīng)用液，暗處反應(yīng)5-20111111，每孔加入50耵21的恥0！1，穩(wěn)定3-5 111111即可用405咖工作波長(zhǎng)測(cè)定00值。
[0033]用包被？83作為陰性對(duì)照，測(cè)波長(zhǎng)為405 11111時(shí)各孔光吸收值，計(jì)算陽性血清與？83光吸收值之比0/?)，當(dāng)彡2.1時(shí)為陽性。
[0034]結(jié)果:陽性:0.796 ；陰性對(duì)照:0.082 (如圖1所示X
[0035]實(shí)施例3:本發(fā)明單克隆抗體的轉(zhuǎn)印免疫印跡法鑒定。
[0036](1)十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳:
①將提取的大菱鲆血清免疫球蛋白1加入等比例含十二烷基磺酸鈉的樣品緩沖液，在沸水中煮5 111111 ；
②將①處理過的樣品加入上樣孔中，每孔內(nèi)加樣品10沿，在恒流條件下，起始時(shí)用低電流(30-40 ―)，待樣品在濃縮膠部分濃縮成一條線后，加大電流(50-70 ―)，電泳至溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳，取出凝膠；
③剪取一塊與電泳凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(孔徑0.22觸)以電轉(zhuǎn)移緩沖液(電轉(zhuǎn)移緩沖液:25 11111101/1 丁!'18-8已86，192 11111101/[甘氨酸，20%甲醇，邱8.3)潤(rùn)濕，放在電泳后的凝膠上。在硝酸纖維素膜上剪掉一個(gè)角，以標(biāo)志樣品順序的起始端。用潤(rùn)濕的濾紙支持，將第二塊潤(rùn)濕的濾紙貼在凝膠片的另一面；按上述放置順序，使膠塊與硝酸纖維素膜及濾紙形成一套夾心的“三明治”；
④將“凝膠三明治”置入盛有電轉(zhuǎn)移緩沖液的電泳槽內(nèi)，將硝酸纖維素膜面向陽極；電泳恒流200 ―，通電5小時(shí)；
⑤轉(zhuǎn)移完畢，取出硝酸纖維素膜。
[0037](2)免疫印跡:
①將硝酸纖維素膜用洗10111111，然后置3%的牛血清白蛋白溶液083配)中封閉
1匕，37。；
②用？83丁洗3次，每次5111111 ；
③將硝酸纖維素膜置于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中，37。緩慢搖動(dòng)1匕；
④同②法洗滌3次；
⑤將硝酸纖維素膜加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠18抗體(1: 4000稀釋)中，37° 0緩慢搖動(dòng)1小時(shí)；
⑥同②法洗滌3次；
⑦把硝酸纖維素膜放入堿性磷酸酶發(fā)色液(他I'-801？發(fā)色液)中發(fā)色，直到顏色清晰為止； ⑧用去離子水洗滌，以終止反應(yīng)。將硝酸纖維素膜夾在濾紙間，干燥。置暗處保存。
[0038]結(jié)果:純化的大菱鲆血清免疫球蛋白1電泳結(jié)果顯示出兩條蛋白帶，分子量分別為78^)21和如圖2，條帶0，本發(fā)明單抗與分子量為78 的大菱鲆血清免疫球蛋白1的重鏈發(fā)生特異性反應(yīng)，顯示出明顯條帶(如圖2，條帶2),而陰性對(duì)照無條帶顯示(如圖2，條帶3)0
[0039]實(shí)施例4:本發(fā)明單抗的間接免疫熒光方法鑒定。
[0040](1)制備大菱鲆外周血，脾和前腎白細(xì)胞懸液。
[0041](2)以雜交瘤上清(雜交瘤培養(yǎng)液)為第一抗體，加白細(xì)胞樣品中，37° 濕盒中孵育45分鐘。
[0042](3) 400 。離心 5 分鐘，用 0.011 ？83 洗三次。
[0043](4)以異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠抗體為第二抗體，加入白細(xì)胞樣品中，37。孵育45分鐘。
[0044](5)同④浸洗，最后一次離心后，加入適量？83沖懸細(xì)胞，滴加在載玻片上，沉降30
1X11110
[0045]熒光顯微鏡下觀察。
[0046]結(jié)果:本發(fā)明單抗與部分大菱鲆各組織中部分淋巴細(xì)胞表面發(fā)生特異性結(jié)合，呈現(xiàn)熒光陽性信號(hào)，在100倍油鏡下可以看到綠色熒光信號(hào)在細(xì)胞膜表面呈散點(diǎn)狀分布(如圖3，八、0和2中黑色箭頭所示X
[0047]實(shí)施例5:本發(fā)明單克隆抗體在檢測(cè)大菱鲆外周血中特異性抗體的應(yīng)用。
[0048]通過間接酶聯(lián)免疫法，利用本發(fā)明單抗檢測(cè)經(jīng)滅活愛德華細(xì)菌免疫后的大菱鲆外周血中特異性抗體的變化。
[0049](1)抗原的制備:在35。0條件下，用普通牛肉蛋白胨瓊脂培養(yǎng)愛德華細(xì)菌40匕無菌清洗后，以福爾馬林滅活(0.5% ^八)；
(2)免疫血清的采集:滅活愛德華細(xì)菌(1^108 ￠6118/1111)與弗氏不完全佐劑等體積混勻，腹腔注射免疫健康大菱鲆(100^1),在免疫后第2，4和6周尾靜脈取血，收集血清。對(duì)照組注射等量？83。
[0050](3)包被抗原:將制備的愛德華細(xì)菌菌液〈IX 108⑶用碳酸鹽包被液(邱9.6) 1:10稀釋，加入96孔酶標(biāo)板中(100沿/孔)，‘。0包被過夜;
(4)吸出包被液，用？831洗滌，每次5111111,洗3次；
(5)每孔加入200耵3%的牛血清白蛋白$83配)37。0封閉1匕；
(6)同②法洗滌3次；
(7)將上述收集的各時(shí)間點(diǎn)血清用？831:3稀釋后，作為第一抗體按每孔100耵加入至酶標(biāo)板，37。溫箱孵育1 11 ；未免疫魚血清為對(duì)照。
[0051](8)同②法洗滌3次；
(9)將上述篩選和克隆出的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為第一抗體按每孔100沿加入至酶標(biāo)板，37。溫箱孵育1 11 ；
(10)同②法洗滌3次；
(11)堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠18(1:4000稀釋)作為第二抗體按每孔100沿加入至酶標(biāo)板，37。溫箱孵育1匕； (12)同②法洗滌3次；然后每孔加入100耵？?jī)?cè)？應(yīng)用液，暗處反應(yīng)5-20 111111，每孔加入50耵21的恥0！1，穩(wěn)定3-5 111111即可用405咖工作波長(zhǎng)測(cè)定00值。
[0052]結(jié)果如圖4所示，與免疫前相比，免疫后大菱鲆外周血中抗愛德華細(xì)菌抗體水平明顯增高，在免疫后第四周達(dá)到最高值(如圖4)。
[0053]實(shí)施例6:本發(fā)明單克隆抗體檢測(cè)大菱鲆外周血，脾和前腎白細(xì)胞中表面免疫球蛋白郵日性淋巴細(xì)胞比例的應(yīng)用。
[0054]通過流式細(xì)胞術(shù)，利用本發(fā)明單抗檢測(cè)大菱鲆外周血，脾和前腎白細(xì)胞中表面免疫球蛋白1陽性淋巴細(xì)胞比例。
[0055](1)白細(xì)胞懸液制備:分別制備大菱鲆外周血、脾和前腎白細(xì)胞懸液。
[0056](2)流式細(xì)胞術(shù):
①粗提的白細(xì)胞約1父107個(gè)用500耵雜交瘤培養(yǎng)上清重懸，4。0孵育1匕；
②680仏4。離心，？88洗滌3次，每次5111111 ；
③加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗小鼠18(1:256稀釋),4。孵育1匕；
④6808，4。0離心，？88洗滌3次，每次5 111111 ；
⑤？83重懸，細(xì)胞懸液經(jīng)200目篩絹網(wǎng)過濾后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0057]結(jié)果如圖5所示:免疫前外周血白細(xì)胞在陰性對(duì)照中，熒光值較低；而經(jīng)抗大菱鲆血清免疫球蛋白1的單克隆抗體反應(yīng)后，熒光值顯著增加，外周血，脾和前腎白細(xì)胞中陽性表面免疫球蛋白陽性淋巴細(xì)胞比例分別為48.07% (圖5,8),20.05% (圖5，0和18.45%〈圖5，的。
[0058]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種抗大菱鮮血清免疫球蛋白M的單克隆抗體，其特征在于:所述的單克隆抗體是由名稱為:雜交瘤細(xì)胞株Sm-1gM，保藏單位為:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:湖北省武漢市武漢大學(xué)，保藏號(hào)為:CCTCC NO:C2014158，保藏日期為:2014年9月2日的雜交瘤細(xì)胞分泌的。
2.—種如權(quán)利要求1所述的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟:將大菱鲆血清經(jīng)鹽析結(jié)合柱層析法純化得到大菱鲆血清免疫球蛋白M ;以純化的大菱鲆血清免疫球蛋白M為抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞；經(jīng)免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法，篩選出分泌抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞Sm-1gM ;其分泌的抗體即為抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的鹽析結(jié)合柱層析法是將大菱鲆血清經(jīng)飽和硫酸銨分步鹽析后，經(jīng)HiTrap?Protein A親和層析柱進(jìn)一步純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的免疫學(xué)檢測(cè)篩選方法是間接酶聯(lián)免疫法、轉(zhuǎn)印免疫印跡法和免疫熒光法。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的間接酶聯(lián)免疫法是將細(xì)胞融合后所得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與純化的大菱鲆血清免疫球蛋白M于96孔酶標(biāo)板中反應(yīng)；繼而加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體；405 nm工作波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值，篩選抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體，即雜交瘤細(xì)胞Sm-1gM分泌的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)印免疫印跡法是將雜交瘤細(xì)胞Sm-1gM分泌的單克隆抗體與轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜的大菱鲆血清免疫球蛋白M反應(yīng)，確定該單抗的抗原決定簇位于分子量為78 kDa的大菱鲆血清免疫球蛋白M的重鏈上。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗大菱鲆血清免疫球蛋白M單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的免疫熒光法是將雜交瘤細(xì)胞株Sm-1gM分泌的單克隆抗體與大菱鲆外周血白細(xì)胞反應(yīng)，確定該單抗可與大菱鲆淋巴細(xì)胞表面免疫球蛋白M結(jié)合。
8.—種如權(quán)利要求1所述抗大菱鲆血清免疫球蛋白M的單克隆抗體在大菱鲆外周血中特異性抗體及各免疫組織中表面免疫球蛋白M陽性淋巴細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104448000SQ201410787121
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月18日
【發(fā)明者】戰(zhàn)文斌, 張偉, 唐小千, 邢婧, 繩秀珍 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)