一種遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因檢測領域，具體涉及一種遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條及試劑盒。所述核酸膜條包括一基底和固定于所述基底上的特異性寡核苷酸探針，所述特異性寡核苷酸探針序列如：SEQ ID NO：1-42。本發(fā)明的另一技術方案為提供一種遺傳性耳聾基因檢測的試劑盒，所述試劑盒包括上述的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測的核酸膜條、PCR反應液I和PCR反應液II。本發(fā)明有益效果在于：本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條及試劑盒包括8對能夠高效特異擴增的引物和42條能特異雜交的探針。本發(fā)明檢測位點較全，做到了2管反應液1張膜條就能夠同時完成21個常見的耳聾位點的檢測。
【專利說明】-種遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條及試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領域，具體涉及一種遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條及試劑 盒。

【背景技術】
[0002] 聽覺系統(tǒng)中傳音、感音及其聽覺傳導通路中的聽神經(jīng)和各級中樞發(fā)生病變，引起 聽功能障礙，產(chǎn)生不同程度的聽力減退，統(tǒng)稱為耳聾。耳聾是嚴重影響人類健康和生活質 量的最常見的疾病之一，估計全世界現(xiàn)有7億多人有中度以上（55dB)的聽力損失。據(jù)我 國2006年第二次全國殘疾人抽樣調查顯示，聽力語言殘疾者達2780萬人，其中單純聽力殘 疾2004萬，占全國8296萬殘疾人的24. 16%。在這些聽力殘疾者人群中0?6歲聽障兒 童80萬，6?14歲聽障兒童11萬，每年新生聾兒3萬（不包括遲發(fā)性聾以及藥物性聾）。 據(jù)統(tǒng)計，約60%耳聾由遺傳因素導致的，其中約70%為非綜合征型耳聾。非綜合征型耳聾 具有高度的遺傳異質性，可以多種方式遺傳給下一代，包括：常染色體顯性遺傳（DFNA)，占 20 %?25% ;常染色體隱性遺傳（DFNB)，占75 %?80% ;X連鎖遺傳（DFN)，占1% ;線粒體 突變母系遺傳，約為1 % ;Y連鎖遺傳（相關染色體位點命名為DFNY)，目前只有王秋菊等報 道過一個中國耳聾相關家系；其中，常染色體隱性遺傳性耳聾，多表現(xiàn)為學語前耳聾；常染 色體顯性遺傳性耳聾則多表現(xiàn)為學語后的進行性發(fā)展的耳聾。
[0003] 遺傳性耳聾可由多種基因導致。根據(jù)癥狀可分為非綜合征型耳聾（nonsyndromic hearingloss，NSHL)和綜合征型耳聾（syndromic hearing loss，SHL)。至 2014年 10 月為止 共定位NSHL基因位點有145個，包括DFNA位點57個，DFNB位點80個，DFN位點5個，DFNY 位點1個，修飾基因位點2個。近期在我國國內(nèi)開展的大規(guī)模耳聾分子流行病學研究表明： 我國非綜合征性耳聾主要由以下幾個基因引起，如GJB2、GJB3、SLC26A4、mtDNA 12srRNA。
[0004] 耳聾的高發(fā)生率及高度的遺傳異質性，要求建立切實有效的基因檢測方法，有效 的基因檢測和預防措施對于減少耳聾的發(fā)生具有重大的作用。目前，基因診斷方法包括：聚 合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP)、限制酶切指紋-單鏈構象多態(tài)性 分析（REF-SSCP)、變性高效液相色譜分析（DHPLC)、基因芯片、直接測序（DS)等。
[0005] 采用基因檢測方法的耳聾檢測產(chǎn)品有博奧生物集團的九項遺傳性耳聾基因檢測 試劑盒（微陣列芯片法）和十五項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒（微陣列芯片法）、濟南 英盛生物技術有限公司的耳聾基因 GJB2 235delC檢測試劑盒（熒光PCR法）、智海生物工 程（北京）有限公司的藥物性耳聾基因突變檢測試劑盒（熒光PCR法）、中生北控生物科技 股份有限公司的四項耳聾基因檢測試劑盒（ARMS-PCR法）、山東三月三基因技術有限公司 的線粒體DNA A1555G突變檢測試劑盒（PCR-酶切法），這些產(chǎn)品各有其優(yōu)點，但是都有一定 的缺點，或者不能定性，或者耗時費力、所需設備昂貴，最重要的是這些產(chǎn)品大部分難以同 時對不同基因的多個突變位點進行檢測。鑒于遺傳性耳聾基因突變異質性強，涉及的基因 多，位點多，以及人群攜帶致病基因比例高等特點，因此有必要建立一種高通量、高效率、經(jīng) 濟的基因突變檢測方法及產(chǎn)品，以實現(xiàn)臨床快速檢測或大規(guī)模的人群篩查。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種高通量、高效率、經(jīng)濟的遺傳性耳聾基因檢測的核酸 膜條及試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的技術方案為提供一種遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條，包括一基底和 固定于所述基底上的特異性寡核苷酸探針，所述特異性寡核苷酸探針序列如：SEQ ID NO: 1-42。
[0008] 本發(fā)明的另一技術方案為提供一種遺傳性耳聾基因檢測的試劑盒，所述試劑盒包 括上述的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測的核酸膜條、PCR反應液I和PCR反應液II ;所 述PCR反應液I包括如下4對引物：引物GJB2F:SEQ ID N0:43;引物GJB2R:SEQ ID NO: 44 ;引物 mtDNAF :SEQ ID NO :45 ;引物 mtDNAR :SEQ ID NO :46 ;引物 2168F :SEQ ID NO :47 ; 引物2168R:SEQIDN0:48;引物IVS7F :SEQIDN0:49;引物IVS7R:SEQIDN0 :50;所述 PCR反應液II包括如下4對引物：引物GJB3F:SEQIDN0:51 ;引物GJB3R:SEQIDN0:52; $*1174F:SEQIDN0:53d|*1174R:SEQIDN0:54d|* 1975F:SEQIDN0:55d|* 1975R :SEQ ID NO :56 ;引物 IVS15F :SEQ ID NO :57 ;引物 IVS15R :SEQ ID NO :58。
[0009] 本發(fā)明有益效果在于：本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條及試劑盒包括8對 能夠高效特異擴增的引物和42條能特異雜交的探針，此引物和探針長度或位置均經(jīng)過精 心設計，其中，特異性寡核苷酸探針中的突變探針及其正常對照探針分別設在兩條不同的 鏈上，防止雜合子突變位點的兩條探針競爭產(chǎn)物。在位點較多的片段，所述特異性寡核苷酸 正常對照探針盡量均分在正、負鏈上。在GC含量高的位點，所述特異性寡核苷酸探針人為 引入錯配堿基，提高探針的結合的特異性。在探針跟產(chǎn)物結合效率不高的位點，所述特異性 寡核苷酸探針設計成鎖核酸探針（LNA)，提高探針的結合效率。
[0010] 本發(fā)明試劑盒可以一次試驗檢測非綜合征遺傳性耳聾四個熱點基因上21個位點 突變，檢測位點多，檢測靈敏度高、特異性強和重復性好。且做到了 2管反應液1張膜條就 能夠同時完成21個耳聾位點的檢測?？梢匀庋壑苯优凶x結果，儀器要求只需要一臺普通 的PCR儀和一臺雜交儀就可滿足實驗檢測，檢測時間短、成本低、操作方便。本發(fā)明試劑盒 是一種高通量、高效率、經(jīng)濟的基因突變檢測產(chǎn)品，實現(xiàn)了臨床快速檢測或大規(guī)模的人群篩 查，實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早干預，控制聾啞殘疾的發(fā)生，具有重大的社會效益。

【具體實施方式】
[0011] 為詳細說明本發(fā)明的技術內(nèi)容、構造特征、所實現(xiàn)目的及效果，以下結合實施方式 詳予說明。
[0012] 本發(fā)明最關鍵的構思在于：本發(fā)明遺傳性耳聾基因檢測的試劑盒的引物和探針長 度、位置和標記方式均經(jīng)過精心設計，可以一次試驗檢測21個位點突變，且在2管反應液1 張月旲條就能夠完成檢測。
[0013] 實施例1
[0014] 本發(fā)明【具體實施方式】如下：
[0015] 1、技術基礎
[0016] 根據(jù)非綜合征遺傳性耳聾流行病調查結果來確定要檢測的基因及其具體位點。根 據(jù)確定的區(qū)域設計PCR引物以擴增獲得GJB2、GJB3、SLC26A4和12SrRNA上的各目的DNA片 段；根據(jù)所需檢測的基因序列特點設計特異的雜交探針；通過PCR產(chǎn)物與探針雜交、信號顯 色和結果判讀來進行耳聾基因的診斷。
[0017] 1.1基因芯片設計
[0018] 根據(jù)DNA芯片檢測目標，從相關基因數(shù)據(jù)庫中選取特異性基因序列作為探針；根 據(jù)所選用的核酸序列進行探針序列及其布局設計，針對個別探針的序列特殊性，進行特殊 標記或設計，使所設計的探針組合對待測基因的雜交特異性強、探針之間的關聯(lián)性好、探針 陣列及其空間布局的優(yōu)化；其主要優(yōu)點是可以同時檢測非綜合征遺傳性耳聾四個熱點基因 上21個位點突變，包括GJB2上6種突變型、GJB3上2種突變型、SLC26A4上10種突變型和 12S rRNA上3種突變型。簡便易行，技術要求低，并且探針不受探針分子大小種類的限制， 能根據(jù)使用者的要求簡便地制出符合目的的芯片。
[0019] 膜條上的探針排列順序如表1所示，由斑點顯現(xiàn)的位置即可判斷結果。經(jīng)由芯片 閱讀儀掃描讀取分析結果，必要時可進行DNA序列分析，以證實結果的準確性。
[0020] 根據(jù)選擇的非綜合征遺傳性耳聾四個熱點基因上21個位點突變，包括GJB2上6 種突變型、GJB3上2種突變型、SLC26A4上10種突變型、和12S rRNA上3種突變型，設計探 針陣列（14 X 3)如表1。
[0021] 表1本發(fā)明試劑盒的膜條陣列
[0022]

【權利要求】
1. 一種遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條，包括一基底和固定于所述基底上的特異性寡 核苷酸探針，其特征在于，所述特異性寡核苷酸探針序列如：SEQ ID NO :1-42。
2. 根據(jù)權利要求1所述的遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條，其特征在于，所述基底為 尼龍膜。
3. 根據(jù)權利要求1所述的遺傳性耳聾基因檢測的核酸膜條，其特征在于，所述特異性 寡核苷酸探針的3'端進行氨基標記。
4. 一種遺傳性耳聾基因檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述 的遺傳性耳聾基因檢測試劑盒檢測的核酸膜條、PCR反應液I和PCR反應液II ; 所述PCR反應液I包括如下4對引物： 引物 GJB2F :SEQ ID NO :43 ; 引物 GJB2R :SEQ ID NO :44 ; 引物 mtDNAF :SEQ ID NO :45 ; 引物 mtDNAR :SEQ ID NO :46 ; 引物 2168F :SEQ ID NO :47 ; 引物 2168R :SEQ ID NO :48 ; 引物 IVS7F :SEQ ID NO :49 ; 引物 IVS7R :SEQ ID NO :50 ; 所述PCR反應液II包括如下4對引物： 引物 GJB3F :SEQ ID NO :51 ; 引物 GJB3R :SEQ ID NO :52 ; 引物 1174F :SEQ ID NO :53 ; 引物 1174R :SEQ ID NO :54 ; 引物 1975F :SEQ ID NO :55 ; 引物 1975R :SEQ ID NO :56 ; 引物 IVS15F :SEQ ID NO :57 ; 引物 IVS15R :SEQ ID NO :58。
5. 根據(jù)權利要求4所述的遺傳性耳聾基因檢測的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反 應液I和PCR反應液II均采用了 2'-脫氧-5' -三磷酸尿苷-尿嘧啶-N-糖苷酶防污染體 系。
6. 根據(jù)權利要求4所述的遺傳性耳聾基因檢測的試劑盒，其特征在于，所述引物5'端 均標記生物素。
7. 根據(jù)權利要求4所述的遺傳性耳聾基因檢測的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應 液I各組分含量為：
所述 dNTP 包括 dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP ;
【文檔編號】C12Q1/68GK104498609SQ201410795807
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權日:2014年12月18日
【發(fā)明者】劉晶晶, 梁少明, 危林耿, 向筑 申請人:亞能生物技術（深圳）有限公司