花生四烯酸的制備方法
【專利摘要】花生四烯酸的制備方法，涉及花生四烯酸。對高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基分批發(fā)酵，在優(yōu)化培養(yǎng)基中以酵母粉和玉米漿為氮源分批發(fā)酵，再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進(jìn)行培養(yǎng)，將優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基；對高山被孢霉在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中分批發(fā)酵；對高山被孢霉高糖馴化及對馴化后的菌種在混合氮源優(yōu)化培養(yǎng)基中分批發(fā)酵，再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，菌體生長正常，未發(fā)生自溶現(xiàn)象，并獲得干菌體、油脂和ARA。
【專利說明】花生四烯酸的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及花生四烯酸，尤其是涉及花生四烯酸的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 花生四烯酸（Arachidonic Acid,簡稱ARA，即5,8,11，14-二十碳四烯酸）屬于 ω-6系列長鏈多不飽和脂肪酸，由于人體內(nèi)不具備相應(yīng)的酶系統(tǒng)來合成特定的不飽和雙 鍵，因此被認(rèn)為是人體必需脂肪酸，是許多二十碳衍生物如前列腺素 E2(PGE2)、前列環(huán)素 (PGI2)、血栓烷 A2 (TXA2)、白三烯 Leukotirene B4 (LTB4)和 C4 (LTC4)的直接前體。ARA 還具 有調(diào)節(jié)體內(nèi)多種離子通道作用，控制細(xì)胞膜的通透性，維持機(jī)體保水性等許多重要的生理 功能。同時(shí)研究表明，花生四烯酸對嬰兒的大腦發(fā)育和視覺功能的完善有著極為重要的意 義，花生四烯酸對高血壓、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的預(yù)防與治療也有顯著的效果 (Roger et al. Biotechnology Bioengineering，2010, 9 (20): 245-257)。因此，花生四烯酸 既是一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑，又是人類重要的保健品。ARA作為人體必需脂肪酸發(fā)揮著無可替代的 作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0003] ARA主要來源有植物、動物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但ARA在動物組織 中含量低，來源也有限，而微生物發(fā)酵法則為生產(chǎn)ARA開辟了新途徑，它具有不受原材料及 氣候限制、生長周期短、培養(yǎng)工藝簡單、ARA含量高等特點(diǎn)，近年來已成為國內(nèi)外研究的熱 點(diǎn)。國際上開展產(chǎn)多不飽和脂肪酸（PFUAs)的微生物研究主要集中在以下幾個(gè)方面：（1)產(chǎn) PFUAs菌種的分離與選育；（2)培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝的優(yōu)化；（3)培養(yǎng)方式的研究（包括批 式、補(bǔ)料、連續(xù)培養(yǎng)工藝等）；(4)PFUAs的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定。目前，人們僅發(fā)現(xiàn)接合菌綱 是比較具有研究價(jià)值的的一個(gè)綱，而且普遍看好被孢霉，認(rèn)為它是生產(chǎn)ARA、EPA、DHA最有 潛力的菌種。目前，日本、美國等國家已經(jīng)先后問世了 ARA的發(fā)酵產(chǎn)品，國內(nèi)在這一領(lǐng)域的 研究起步晚，雖對微生物發(fā)酵生產(chǎn)ARA方面作了一些研究，但還存在著生物量偏低，油脂含 量較低等問題，離大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)仍有一定的距離。
[0004] 中國專利CN101613724公開一種利用高山被孢霉菌絲體制備花生四烯酸的方法， 包括有下述步驟：首先在恒溫?fù)u床中將高山被孢霉接種量的深層培養(yǎng)；再轉(zhuǎn)接于裝有發(fā)酵 培養(yǎng)基的器皿中，培養(yǎng)后獲得發(fā)酵醪液，其中生長培養(yǎng)基或/和發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源以高山 被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以質(zhì)量百分比計(jì)為10%? 90% ;發(fā)酵醪液經(jīng)過濾，收集的霉菌生物體，經(jīng)洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進(jìn)行浸提 或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經(jīng)進(jìn)一步處理獲得目標(biāo)產(chǎn)品，霉菌生物體經(jīng)非極性溶劑浸提 后剩余固體物質(zhì)，即為可循環(huán)使用的高山被孢霉菌柏，該發(fā)明利用高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花 生四烯酸過程中產(chǎn)生的廢棄物得到循環(huán)利用，避免了環(huán)境污染物的排放。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供花生四烯酸的制備方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化的方法為 取4mL種子液接入裝有50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基（葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. Ig/ L ;ΚΗ2Ρ040· 5g/L ;CaC030 . 05g/L ;ZnS04-7H20 0· lg/L ;ρΗ6· 0)的 250mL 三角瓶，28°C、150rpm 培養(yǎng)5?6d，得到優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿lOg/L ;谷氨酸I. Og/L ; MgS04-7H200. lg/L ;ΚΗ2Ρ042· Og/L ;CaC030 . 05g/L ;ZnS04-7H20 0· lg/L ;混合微量元素 lmL/L ; 混合維生素 lmL/L ;pH調(diào)至6. 0 ;
[0008] 2)對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中分別以酵母粉和玉米漿為氮源進(jìn)行了 2L分批發(fā) 酵，再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，菌體生長正常，未發(fā)生自溶現(xiàn)象，并獲得干 菌體、油脂和ARA。
[0009] 在步驟1)中，所述混合微量元素可包括FeCl3 · 6H20,、H3B03、MnCl2 · 4H20、 CoCl2 · 6H20、CuSO4 · 5H20、NiSO4 · 6H20等；所述混合維生素可包括維生素 B12、生物素、維生 素 B1、泛酸鈣等。
[0010] 在步驟2)中，所述發(fā)酵的條件可為：將培養(yǎng)3d的液體種子，按10%接種量接種于 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，裝液量I. 5L，初始葡萄糖濃度為60g/L，在28°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量 Ivvm ;所述干菌體可得21g/L,油脂可得9g/L, ARA可得3. 8g/L。 toon] 所述高山被孢霉可以接種適量的被孢霉至載有培養(yǎng)基的搖瓶中，置于搖床上培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為100?300rpm，較好的為150?200rpm。
[0012] 本發(fā)明涉及的培養(yǎng)基的組成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用 蔗糖、麥芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是較適宜的碳源，來源簡單，價(jià)格低廉，使用量為30? 80g/L。對于搖瓶種子培養(yǎng)，一般將使用量降低至10?30g/L，可根據(jù)培養(yǎng)的時(shí)間及所要求 的生物量密度來選擇用量。具體合適的用量選擇，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)操作確 定碳源的種類及合適用量。同時(shí)，可視微生物的生長情況，選擇一次性加入全部碳源或者分 批補(bǔ)入。氮源可以選擇酵母粉、玉米漿、蛋白胨、大豆粉等中的至少一種，酵母粉或者玉米漿 被認(rèn)為是比較好的氮源，添加濃度在5?15g/L，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作 確定氮源的種類及用量。
[0013] 可選擇使用單一氮源或混合氮源，更好的結(jié)果是使用混合氮源（玉米漿、酵母粉） 為發(fā)酵罐培養(yǎng)的適宜氮源，且二者的質(zhì)量比例對于油脂的積累影響較大，可利用響應(yīng)面分 析等統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)一步優(yōu)化碳氮源的組合，較好的兩種氮源比例為3:8 (w/w)。
[0014] 溫度低于20°C高山被孢霉將會開始大量產(chǎn)生EPA，而培養(yǎng)要求得到較高含量的 ARA，同時(shí)盡量減低或避免產(chǎn)生EPA，培養(yǎng)溫度通常保持在25?30°C。微生物發(fā)酵生產(chǎn) PUFAs，其最高產(chǎn)量一般是在對數(shù)期后期或穩(wěn)定期前期，因此要在最短的時(shí)間內(nèi)獲得最大可 能的生物量及總脂肪酸的含量，一般來說，最適收獲ARA的時(shí)間是在第5?6天。
[0015] 真菌生長的pH范圍較廣，更偏好于在偏酸環(huán)境中生長，pH在4. 0至8. 0之間均可 以正常生長，本發(fā)明的實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)，初始pH 6. 0?6. 5,培養(yǎng)過程中pH在7?8之間有 利于ARA的積累；pH 4?5之間有利于生物量的積累，在培養(yǎng)過程中可分階段的調(diào)節(jié)pH水 平以適應(yīng)所要求的生長環(huán)境。
[0016] 接種量可以在2%至14% (V/V)，接種量低，生物量達(dá)不到所要求的水平，接種量 高，在生物量積累到一定程度將會抑制菌體的繼續(xù)生長，在搖瓶培養(yǎng)中，接種控制在3 %? 5% (V/V)，而在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，接種量控制在8%?10% (V/V)能得到較好的結(jié)果。
[0017] 培養(yǎng)基中碳氮比影響真菌油脂的積累，碳氮比在10 : 1至60 : 1之間，較好的是 40 : 1至50 : 1，在培養(yǎng)過程中可以選擇滅菌前一次性加入或培養(yǎng)開始后分批加入。
[0018] 微生物的生長需要維生素等生長因子，當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境中缺乏維生素時(shí)，細(xì)胞內(nèi)RNA、 DNA以及蛋白質(zhì)的含量會下降。添加維生素 B1、維生素 B12、生物素及泛酸鈣最有利于ARA的 積累，其用量分別在50?150mg/L、300?600μ g/L、400?600μ g/L及80?150mg/L之 間。谷氨酸可以提高細(xì)胞中G6TOH的活性，為被孢霉細(xì)胞的生長提供核酸原料，從而與花生 四烯酸的合成緊密相關(guān)，在培養(yǎng)基中添加〇. 5?2g/L的谷氨酸有利于ARA的積累。
[0019] 為了提高高山被孢霉的耗糖能力及保存過程中的穩(wěn)定性，可對菌種進(jìn)行了高糖馴 化培養(yǎng)，馴化后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌種的耗糖能力及產(chǎn)油能力明顯提升，ARA的含量呈倍數(shù)增長。
[0020] 發(fā)酵培養(yǎng)過程可采用分批發(fā)酵或補(bǔ)料-分批發(fā)酵，分批發(fā)酵要求營養(yǎng)物質(zhì)一次性 加入，營養(yǎng)物含量過高可能在培養(yǎng)前期抑制真菌的生長而延長延滯期，發(fā)酵周期隨之延長， 而營養(yǎng)物含量過低，在培養(yǎng)后期無法滿足真菌生長需要的營養(yǎng)補(bǔ)充。本領(lǐng)域的技術(shù)人員，可 以通過一系列實(shí)驗(yàn)操作確定適宜的碳氮營養(yǎng)物含量；補(bǔ)料-分批發(fā)酵培養(yǎng)過程中，必須對 培養(yǎng)液中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行檢測，特別是當(dāng)葡萄糖濃度小于5g/L時(shí)，需要及時(shí)補(bǔ)充葡萄糖， 這是需要分別滅菌的。上述兩種培養(yǎng)方式，在實(shí)施過程中，可能會出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，這是不希 望出現(xiàn)的，可以選擇在滅菌之間加入適量消泡劑或者在起泡現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)，適時(shí)地加入消泡 劑防止產(chǎn)生過量泡沫。
[0021] 根據(jù)上述優(yōu)化高山被孢霉的發(fā)酵條件，能夠獲得較高的生物量及總油脂含量，可 以每12h或24h取樣測定生物量、油脂及ARA含量，或者培養(yǎng)結(jié)束收獲生物質(zhì)測定。
[0022] 可以用多種方法對生物質(zhì)體進(jìn)行收獲，例如過濾、真空抽濾、離心、膜分離、絮凝沉 淀等，一般的，選擇成本低且方便操作的過濾或真空抽濾收獲生物質(zhì)體。收獲后，可以選擇 采用干菌體或濕菌體進(jìn)行油脂的萃取，本實(shí)施過程中，對菌體進(jìn)行干燥至含水量小于4%， 此時(shí)，使用丙酮、乙醇、異丙醇等醇類、烷烴如正己烷、正庚烷等萃取油脂是較適宜的，但正 己烷最佳。干燥后的菌體加入正己烷，進(jìn)行研磨、勻漿或減法破壁萃取，得到的萃取液進(jìn)行 離心分離取上層，蒸發(fā)除去其中的有機(jī)溶劑，得到總油脂即粗油。
[0023] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：原料易購、價(jià)格適中、培養(yǎng)基配制方 便、發(fā)酵工藝簡便、花生四烯酸合成穩(wěn)定、油脂產(chǎn)量為16?28g/L，其中花生四烯酸產(chǎn)量在 6. 5?16g/L，解決了花生四烯酸的發(fā)酵生產(chǎn)效率和產(chǎn)量低的問題、適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為高山被孢霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0025] 圖2高山被孢霉在添加了維生素、氨基酸和微量元素的培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0026] 圖3高山被孢霉在實(shí)施例3培養(yǎng)基中添加了混合氮源的發(fā)酵結(jié)果。
[0027] 圖4馴化后的高山被孢霉在實(shí)施例4中的培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果。
[0028] 圖1?4分別為實(shí)施例2?5中不同培養(yǎng)基對高山被孢霉的生物量、總油脂和 ARA產(chǎn)量的影響結(jié)果。在圖1?4中，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（h)，左縱坐標(biāo)為葡萄糖消耗情 況Glucose (，g/L)，右縱坐標(biāo)分別為生物量Biomass (·，g/L)，總油脂Total fatty acid ( ★，g/L)和 ARA 產(chǎn)量（▲，g/L)。

【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0030] 實(shí)施例1.利用高山被孢霉生產(chǎn)ARA
[0031] 在一個(gè)250mL搖瓶中培養(yǎng)高山被孢霉，載液量為50mL的活化培養(yǎng)基，150rpm， 28°C，活化3天。再將活化后的菌株接入基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量250mL的搖瓶裝入50mL的基 礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種量10% (v/v)，于28°C往復(fù)式搖床培養(yǎng)5?6d，轉(zhuǎn)速150rpm，28°C，培養(yǎng)5d 后收獲，抽濾收獲生物質(zhì)，將其恒溫干燥至恒重，用正己烷研磨萃取油脂，蒸發(fā)除去有機(jī)容 劑后，得到總油脂5g/L。
[0032] 活化培養(yǎng)基組成（g/L):
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 花生四烯酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 通過搖瓶實(shí)驗(yàn)對高山被孢霉產(chǎn)ARA的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所述優(yōu)化的方法為取 4mL種子液接入裝有50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250mL三角瓶，28°C、150rpm培養(yǎng)5?6d，得到 優(yōu)化培養(yǎng)基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿10g/L ;谷氨酸1. Og/L ;MgS04-7H200. lg/L ; KH2P042. Og/L ;CaC030. 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;混合微量元素 lmL/L ;混合維生素 lmL/ L ;pH調(diào)至6. 0 ;所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. lg/L ; KH2P040. 5g/L ；CaC030. 05g/L ；ZnS04-7H20 0. lg/L ；pH 6. 0 ； 2) 對高山被孢霉在優(yōu)化培養(yǎng)基中分別以酵母粉和玉米漿為氮源進(jìn)行了 2L分批發(fā)酵， 再以酵母粉為氮源進(jìn)行的發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，菌體生長正常，未發(fā)生自溶現(xiàn)象，并獲得干菌 體、油脂和ARA。
2. 如權(quán)利要求1所述花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述混合微量 元素包括 FeCl3 ? 6H20,、H3B03、MnCl2 ? 4H20、CoCl2 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、NiS04 ? 6H20。
3. 如權(quán)利要求1所述花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述混合維生 素包括維生素B12、生物素、維生素&、泛酸鈣。
4. 如權(quán)利要求1所述花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述發(fā)酵的條 件為：將培養(yǎng)3d的液體種子，按10 %接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，裝液量1. 5L，初始葡萄糖 濃度為60g/L，在28°C，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量lvvm。
【文檔編號】C12R1/645GK104388486SQ201410800324
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】盧英華, 曾思鈺, 凌雪萍, 敬科舉, 吳意珣, 陳翠雪 申請人:廈門大學(xué)