一種從葡萄酒中提取葡萄基因組dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種從葡萄酒中提取葡萄基因組DNA的方法，包括如下步驟，1)DNA富集；2)多糖的去除；3)DNA粗提；4)DNA純化；5)DNA回收，獲得葡萄基因組DNA。本方法提取出的DNA溶液澄清透亮，提取純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好，并具較好的完整性。
【專利說明】-種從葡萄酒中提取葡萄基因組DNA的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種從葡萄酒中提取葡萄基因組DNA的方 法。

【背景技術】
[0002] 葡萄酒的分子鑒定包括葡萄酒中葡萄DNA的提取和下游分子生物學分析兩個部 分，其中從葡萄酒中獲得高質(zhì)量的葡萄DNA是進行下游分子生物學分析的基礎。植物基因 組DNA提取方法已較為成熟，基于CTAB法和SDS法等傳統(tǒng)方法，適于不同類型植物材料的 DNA提取方法已經(jīng)廣泛應用，甚至開發(fā)成為商品化的植物DNA提取試劑盒。然而，這些DNA 提取方法均不適用于葡萄酒中的葡萄DNA提取。
[0003] 葡萄酒為高度深加工產(chǎn)品，其生產(chǎn)過程歷經(jīng)發(fā)酵、轉(zhuǎn)瓶、陳釀、澄清和過濾等諸多 環(huán)節(jié)，成品葡萄酒中DNA含量極微，且由葡萄漿果引入葡萄酒中的大量的多酚類（單寧）、多 糖、有機酸等復雜的化學物質(zhì)，嚴重影響DNA提取質(zhì)量及下游的分子生物學分析，目前尚未 見報道一種能夠達到應用水平的葡萄酒DNA提取方法，也沒有成熟的商品化試劑盒。2000 年至今，關于果汁、新酒或陳釀的葡萄酒中DNA提取及分析的研究報道層出不窮。已有研究 表明：即使經(jīng)過發(fā)酵，葡萄酒中依然存在微量的葡萄DNA，采用分子生物學手段進行用果汁 或葡萄酒中的葡萄DNA分析是可行的。從葡萄酒中提取出足量且優(yōu)質(zhì)的葡萄DNA和篩選出 葡萄特異性的PCR引物是應用分子生物學手段鑒別葡萄酒中葡萄品種的前提，也是目前葡 萄酒基因鑒偽技術研究的關鍵點和難點。在成功的提取出適宜進行下游分子生物學實驗的 葡萄DNA后，可以進行葡萄特異性基因的檢測，以判斷是否用葡萄原汁釀造；可以進行微衛(wèi) 星位點擴增，通過與相關葡萄微衛(wèi)星位點數(shù)據(jù)庫比對，從而鑒別出葡萄酒中的葡萄品種。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種從葡萄酒中提取葡萄基因組DNA的方法，該方法提取 純化效率高，得到的DNA濃度高、純度好，并具較好的完整性。
[0005] 本發(fā)明為達到其目的，采用的技術方案如下：
[0006] 一種從葡萄酒中提取葡萄基因組DNA的方法，包括如下步驟，
[0007] 1)DNA富集：向20?30mL葡萄酒中加入180?220ii g糖元、0? 5?1. 2v/v%的 3 -巰基乙醇和0. 7?1倍體積的異丙醇，混勻后，置于-65°C?_75°C冰箱中1?1. 5h，然 后移至-18°C?-20°C沉淀12h?24h，使葡萄酒中的DNA沉淀，之后離心，收集沉淀；此步 驟能夠有效的富集葡萄酒中殘存的葡萄DNA碎片，縮短DNA富集所需的時間。由于葡萄酒 中含有較多的酚類物質(zhì)，容易褐化，色素較難清除，采用該特定步驟，添加用量的試劑，可有 效避免酚類氧化，且助于DNA沉劑。
[0008] 2)多糖的去除：向步驟1)獲得的沉淀中加入0.8?lmL去多糖緩沖液，冰浴、混 勻、離心、棄上清，向其中再次加入去多糖緩沖液，冰浴、混勻、離心、棄上清；
[0009] 3)DNA粗提：向其中加入55?65°C預熱的700?800 i! L粗提緩沖液，混勻，于 55?65°C水浴30?40min，期間顛倒混勻3?4次，然后離心，收集上清液；
[0010] 4)DNA純化：向步驟3)獲得的上清液中，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合 液，混勻后離心，收集上清液，向上清液中加入RNase A溶液進行酶解，然后加入等體積的氯 仿/異戊醇混合液，混勻后離心，取上清；
[0011] 5)DNA回收，獲得葡萄基因組DNA。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟1)中，在DNA富集沉淀后，溶液在4°C條件下6, 000g?7, 000g 離心30min?40min，收集沉淀。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述的去多糖緩沖液溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物 質(zhì)：80 ?120mmol/L pH 值為 8. 0 的 Tris-HCl、4 ?6mmol/L EDTA-Na2、0. 20 ?0? 25mmol/L NaCl和質(zhì)量體積比為1. 5?2. 5%的PVP-40T。步驟2)中加入一定量的PVP能絡合多酚和 萜類物質(zhì)，可阻止多酚物質(zhì)氧化為醌，能有效防止多酚的污染；添加本發(fā)明特定的去多糖緩 沖液，能有效的去除色素、多糖和酚類物質(zhì)，提取液會明顯變得澄清。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟2)中，多糖去除的具體步驟如下：
[0015] a)首先向裝有上述DNA沉淀的50mL離心管中加入0. 8mL?lmL預冷的去多糖緩 沖液，將離心管壁上的沉淀全部沖洗下來，將沉淀全部轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，冰浴5?8min， 期間顛倒混勻1次；
[0016] b)將冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g離心5?8min，棄上清；
[0017] c)在50mL離心管中再次加入0. 5?0. 8mL預冷的去多糖緩沖液，將沉淀全部轉(zhuǎn)移 至步驟a)中所述2mL離心管中，吹打混勻沉淀和溶液后冰浴5?8min，期間顛倒混勻1? 2次；
[0018] d)冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g離心5?8min，棄上清。
[0019] 優(yōu)選地，步驟3)中，所述的粗提緩沖液溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)：18? 22mmol/L EDTA、8 ?12mmol/L pH 值為 8. 0 的 Tris-HCl、l. 2 ?1. 6mol/L NaCl、l. 8 ? 2. 2w/v% CTAB、0. 8 ?1. 2v/v%巰基乙醇、1. 8 ?2. 2w/v% PVP-40T、18 ?22mg/mL 蛋白酶 K。在 Tris-HCl-EDTA(pH 8. 0)的弱堿性緩沖液中，1. 8% -2. 2% (w/v)的 CTAB 配合 1. 2 ? 1. 6mol/L NaCl可以有效的從葡萄酒中提取出DNA。
[0020] 優(yōu)選地，所述步驟3)中，離心的條件為：在4°C 12, 000g?13000g離心8?10min。
[0021] 優(yōu)選地，步驟4)中所述的DNA純化按照如下步驟進行：
[0022] a)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，渦旋震蕩混勻后，在4 °C條件下 12, 000g?13000g離心8?10min，所述苯酚/氯仿/異戊醇混合液中，苯酚、氯仿和異戊 醇的體積比為25 :24 :1 ;
[0023] b)吸取上清液至另一新的1. 5mL離心管，加入5?8 ii L濃度為10mg/mL的RNase A于37°C酶解20?30min，所述RNase A的濃度為10mg/mL ;
[0024] c)加入等體積的氯仿/異戊醇混合液渦旋震蕩混勻后，在4°C條件下12, 000g? 13000g離心8?10min，取上清，所述氯仿/異戊醇混合液中，氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1〇
[0025] 經(jīng)DNA提取緩沖液裂解得粗提DNA后，用苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)與氯仿 /異戊醇（24:1)分次抽提，可以進一步去除蛋白質(zhì)和酚類等雜質(zhì)。
[0026] 優(yōu)選地，步驟5)中所述的DNA回收按照如下步驟進行：
[0027] a)向步驟4)獲得的上清液中加入0. 1倍體積的摩爾濃度為3?5mol/L的醋酸鈉 溶液、5?8 y g糖元和0. 6倍體積的異丙醇，于-18°C?_20°C沉淀DNA 12?24h ;
[0028] b)在4°C條件下12,000g?13000離心5?8min，收集DNA沉淀，棄上清，用洗滌 緩沖液洗滌沉淀，之后在4°C條件下13, 000g離心2min，收集沉淀；
[0029] (：)用75￥八％的乙醇洗滌沉淀，然后在41：條件下12,000?13,00(^離心21^11、 揮去乙醇，加入50 ii L Tris-EDTA在65°C下水浴15min溶解DNA。
[0030] 優(yōu)選地，所述醋酸鈉溶液的pH值為5. 0?5. 5。
[0031] 優(yōu)選地，所述洗滌緩沖液含有70?76v/v%的乙醇和8?12mmol/L的醋酸銨，溶 劑為水。
[0032] 試驗結果表明，與現(xiàn)有技術相比，本方法提取出的DNA溶液澄清透亮，提取純化效 率高，得到的DNA濃度高、純度好，并具較好的完整性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1 :實施例1中紅葡萄酒VvNCED基因?qū)崟r熒光PCR檢測結果；
[0034] 圖2 :實施例2中白葡萄酒VvNCED基因?qū)崟r熒光PCR檢測結果；
[0035] 圖3 :實施例1中紅葡萄酒VrZAG62微衛(wèi)星位點分析的結果圖；
[0036] 圖4 :實施例1中紅葡萄酒MMD7微衛(wèi)星位點分析的結果圖；
[0037] 圖5 :實施例2中白葡萄酒VrZAG62微衛(wèi)星位點分析的結果圖；
[0038] 圖6:實施例2中白葡萄酒MMD7微衛(wèi)星位點分析的結果圖；
[0039] 圖7 :5種方法提取白葡萄酒VvNCED基因?qū)崟r熒光PCR檢測結果，其中，1-陽性對 照，2-實施例2提取，3?7為方法1-4提取結果（和陰性對照曲線有重疊）；
[0040] 圖8 :5種方法提取紅葡萄酒VvNCED基因?qū)崟r熒光PCR檢測結果，其中，1-陽性對 照，2-實施例1提取，3?7為方法1-4提取結果（和陰性對照曲線有重疊）。

【具體實施方式】
[0041] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步說明，但本發(fā)明并不限于以 下實施例。
[0042] 實施例1提取純化市售紅葡萄酒中的DNA
[0043] 1、提取純化市售紅葡萄酒中的DNA
[0044]1)、DNA 富集
[0045] 取30mL葡萄酒于50mL的離心管中，依次分別加入220ii g糖元、0? 5% 3 -巰基乙 醇（V/V)和0. 7倍體積的異丙醇，充分混勻后，置于-75°c冰箱lh，然后移至-18°c沉淀約 12h，使葡萄酒中DNA沉淀，之后在4°C條件下7, 000g離心40min，收集沉淀。
[0046] 2)多糖的去除
[0047] 向步驟1)獲得的沉淀中加入0. 8mL預冷的去多糖緩沖液[80mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，6m mol/L EDTA-Na2,0.25mmol/L NaCl，1.5% (w/v)PVP-40T]，用移液搶 吹打?qū)㈦x心管壁上的沉淀全部沖洗下來后，盡量全部轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，冰浴5min，期間 顛倒混勻1次。
[0048] 將2mL離心管在4°C 13, 000g離心5min，棄上清。
[0049] 在50mL離心管中再次加入0. 5mL預冷的去多糖緩沖液，用移液搶吹打再次將離心 管中的沉淀全部轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，用移液搶吹打混勻后冰浴5min，期間顛倒混勻1?2 次。
[0050] 將2mL離心管在4°C 13, 000g離心5min，棄上清。
[0051] 3)DNA 粗提
[0052] 加入65°C預熱的 700ii L粗提緩沖液[18mmol/L EDTA，8mmol/L Tris-HCl pH 8. 0， 1.2mol/L NaCl 和 1.8% (w/v)CTAB，并在使用前加入 0.8% (v/v)巰基乙醇，1.8% (w/v) PVP-40T，蛋白酶K(18mg/mL)]，渦旋振蕩混勻，于55°C水浴40min，期間顛倒混勻3次。在 4°C 12, 000g離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的2mL離心管。
[0053] 4) DNA 純化
[0054] 加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)，渦旋震蕩混勻后，在4°C條件下13, 000g 離心8min。
[0055] 吸取上清液至另一新的1. 5mL離心管，加入5 ii L RNase A(10mg/mL)于37°C酶解 30min〇
[0056] 加入等體積氯仿：異戊醇（24 :1)渦旋震蕩混勻后，在4°C條件下13, 000g離心 8min，取上清。
[0057] 5)DNA 回收
[0058] 加入0? 1倍體積醋酸鈉（3mol/L, pH = 5)，5 ii g糖元和0? 6倍體積的異丙醇， 于-20°C過夜沉淀DNA約24h。
[0059] 在4°C條件下13, 000g離心5min，收集DNA沉淀，棄上清，用洗滌緩沖液（76%乙醇 和12mmol/L醋酸銨）洗漆沉淀，并在4°C條件下13, 000g離心2min。
[0060] 收集沉淀，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，并在4°C條件下13,000g離心2min。
[0061] 風干或用核酸真空干燥儀烘干乙醇，加入50iiL TE，65°C水浴15min充分溶解 DNA。
[0062] 實施例2提取純化市售白葡萄酒中的DNA
[0063] 1、提取純化市售白葡萄酒中的DNA
[0064] 1)、DNA 富集
[0065] 取20mL葡萄酒于50mL的離心管中，依次分別加入180iig糖元、1.2% 巰基乙 醇（V/V)和1倍體積的異丙醇，充分混勻后，置于-65°C冰箱1. 5h，然后移至-20°C過夜（約 24h)，使葡萄酒中DNA沉淀，之后在4°C條件下6, 000g離心30min，收集沉淀。
[0066] 2)多糖的去除
[0067] 向步驟1)獲得的沉淀中加入lmL預冷的去多糖緩沖液[120mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，4mmol/L EDTA-Na2,0.2mmol/L NaCl，2.5% (w/v)PVP-40T)]，用移液搶吹 打?qū)㈦x心管壁上的沉淀全部沖洗下來后，盡量全部轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，冰浴8min，期間顛 倒混勻1次。
[0068] 將2mL離心管在4°C 12000g離心8min，棄上清。
[0069] 在50mL離心管中再次加入0. 8mL預冷的去多糖緩沖液，用移液搶吹打再次將離心 管中的沉淀全部轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，用移液搶吹打混勻后冰浴8min，期間顛倒混勻1?2 次。
[0070] 將2mL離心管在4°C 12000g離心8min，棄上清。
[0071] 3)DNA 粗提
[0072] 加入 55°C 預熱的 800ii L 粗提緩沖液[22mmol/L EDTA, 12mmol/L Tris-HCl pH 8. 0, 1. 6mol/L NaCl 和 2. 2% (w/v)CTAB，并在使用前加入 1. 2% (v/v)巰基乙醇，2. 2% (w/ v) PVP-40T，蛋白酶K (22mg/mL)]，渦旋振蕩混勻，于65 °C水浴30min，期間顛倒混勻3?4 次。在4°C 12, 000g離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的2mL離心管。
[0073] 4) DNA 純化
[0074] 加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25 :24 :1)，渦旋震蕩混勻后，在4°C條件下12000g 離心lOmin。
[0075] 吸取上清液至另一新的1. 5mL離心管，加入8 ii L RNase A(10mg/mL)于37°C酶解 20min〇
[0076] 加入等體積氯仿：異戊醇（24 :1)渦旋震蕩混勻后，在4°C條件下12000g離心 10min，取上清。
[0077] 5)DNA 回收
[0078] 加入0? 1倍體積醋酸鈉（5mol/L, pH5. 5)，8 ii g糖元和0? 6倍體積的異丙醇， 于-18°C沉淀DNA約12h。
[0079] 在4°C條件下12000離心8min，收集DNA沉淀，棄上清，用洗滌緩沖液（70%乙醇和 8mmol/L醋酸銨）洗漆沉淀，并在4°C條件下13, 000離心2min。
[0080] 收集沉淀，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀，并在4°C條件下12,000g離心2min。
[0081] 風干或用核酸真空干燥儀烘干乙醇，加入50iiL TE(Tris-EDTA)，65°C^Km25min 充分溶解DNA。
[0082] 實施例3 (對實施例1、2的提取結果進行檢測）
[0083] 3.1、DNA 濃度檢測
[0084] 用NAN0DR0P1000對從葡萄酒中提取出的DNA進行濃度測定，結果如下表1所示：
[0085] 表1 DNA提取結果
[0086]

【權利要求】
1. 一種從葡萄酒中提取葡萄基因組DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟， 1. DNA富集：向20?30mL葡萄酒中加入180?220ii g糖元、0? 5?1. 2v/v%的￠-巰 基乙醇和0. 7?1倍體積的異丙醇，混勻后，置于-65°C?-75°C冰箱中1?1. 5h，然后移 至-18°C?-20°C沉淀12h?24h，使葡萄酒中的DNA沉淀，之后離心，收集沉淀； 2) 多糖的去除：向步驟1)獲得的沉淀中加入0. 8?lmL去多糖緩沖液，冰浴、混勻、離 心、棄上清，向其中再次加入去多糖緩沖液，冰浴、混勻、離心、棄上清； 3. DNA粗提：向其中加入55?65°C預熱的700?800 ii L粗提緩沖液，混勻，于55? 65°C水浴30?40min，期間顛倒混勻3?4次，然后離心，收集上清液； 4. DNA純化：向步驟3)獲得的上清液中，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，混 勻后離心，收集上清液，向上清液中加入RNase A溶液進行酶解，然后加入等體積的氯仿/ 異戊醇混合液，混勻后離心，取上清； 5. DNA回收，獲得葡萄基因組DNA。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，在DNA富集沉淀后，溶液在4°C 條件下6, 000g?7, 000g離心30min?40min，收集沉淀。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，所述的去多糖緩沖液溶劑 是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)：80?120mmol/L pH值為8. 0的Tris_HCl、4?6mmol/L EDTA-Na2、0. 20 ?0? 25mmol/L NaCl 和質(zhì)量體積比為 1. 5 ?2. 5%的 PVP-40T。
4. 根據(jù)權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，多糖去除的具體步驟 如下： a) 首先向裝有上述DNA沉淀的50mL離心管中加入0. 8mL?lmL預冷的去多糖緩沖液， 將離心管壁上的沉淀全部沖洗下來，將沉淀全部轉(zhuǎn)移至2mL離心管中，冰浴5?8min，期間 顛倒混勻1次； b) 將冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g離心5?8min，棄上清； c) 在50mL離心管中再次加入0. 5?0. 8mL預冷的去多糖緩沖液，將沉淀全部轉(zhuǎn)移至 步驟a)中所述2mL離心管中，吹打混勻沉淀和溶液后冰浴5?8min，期間顛倒混勻1?2 次； d) 冰浴后的混合液于4°C、12, 000g?13000g離心5?8min，棄上清。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述的粗提緩沖液溶劑是水， 溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)：18?22mmol/L EDTA、8?12mmol/L pH值為8. 0的Tris-HCl、 1. 2 ?1. 6mol/L NaCl、l. 8 ?2. 2w/v% CTAB、0. 8 ?1. 2v/v%巰基乙醇、1. 8 ?2. 2w/v% PVP-40T、18 ?22mg/mL 蛋白酶 K。
6. 根據(jù)權利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，離心的條件為：在 4°C 12, 000g ?13000g 離心 8 ?10min。
7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述的DNA純化按照如下步驟 進行： a) 加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，渦旋震蕩混勻后，在4 °C條件下 12, 000g?13000g離心8?10min，所述苯酚/氯仿/異戊醇混合液中，苯酚、氯仿和異戊 醇的體積比為25 :24 :1 ; b) 吸取上清液至另一新的1. 5mL離心管，加入5?8 y L濃度為10mg/mL的RNase A于 37°C酶解20?30min，所述RNase A的濃度為lOmg/mL ; c)加入等體積的氯仿/異戊醇混合液渦旋震蕩混勻后，在4°C條件下12, OOOg? 13000g離心8?lOmin，取上清，所述氯仿/異戊醇混合液中，氯仿和異戊醇的體積比為24 : 1〇
8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟5)中所述的DNA回收按照如下步驟 進行： a) 向步驟4)獲得的上清液中加入0. 1倍體積的摩爾濃度為3?5mol/L的醋酸鈉溶 液、5?8 y g糖元和0. 6倍體積的異丙醇，于-18°C?_20°C沉淀DNA 12?24h ; b) 在4°C條件下12, 000g?13000離心5?8min，收集DNA沉淀，棄上清，用洗漆緩沖 液洗滌沉淀，之后在4°C條件下13, 000g離心2min，收集沉淀； c) 用75v/v%的乙醇洗漆沉淀，然后在4°C條件下12, 000?13, 000g離心2min、揮去 乙醇，加入50 ii L Tris-EDTA在65°C下水浴15min溶解DNA。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，所述醋酸鈉溶液的pH值為5. 0?5. 5。
10. 根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述洗滌緩沖液含有70?76v/v% 的乙醇和8?12mmol/L的醋酸銨，溶劑為水。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450683SQ201410810893
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權日:2014年12月22日
【發(fā)明者】劉津, 高蘇娟, 劉青, 盧麗, 張雋, 陳源樹, 李婷, 顧瑜娟, 何日榮, 高東微 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 仲愷農(nóng)業(yè)工程學院