一種小麥耐鹽基因TaNAS1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥耐鹽基因 TaNAS1 ，該基因的核苷酸序列的全長(zhǎng)如SEQ ID NO:1所示，該基因的cDNA和gDNA的編碼序列如SEQ ID NO:1中第52位至第1053位所示；本發(fā)明還公開了所述基因 TaNAS1 以及表達(dá)載體在培育耐鹽植物特別是擬南芥中的應(yīng)用。本發(fā)明利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，首次克隆得到了小麥耐鹽基因 TaNAS1 ，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)過(guò)比較分析證明，該轉(zhuǎn)基因擬南芥植株具有較強(qiáng)的耐鹽能力，這為農(nóng)作物耐鹽新品種的研究和培育提供了良好的遺傳材料。
【專利說(shuō)明】一種小麥耐鹽基因TaNASI及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)是一種小麥耐鹽基因TaNASlR實(shí)應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]土壤鹽漬化是人類面臨的生態(tài)危機(jī)之一，土壤的鹽漬化問(wèn)題日益威脅著人類賴以生存的有限的土地資源，鹽脅迫已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最重要的環(huán)境脅迫因子。因此，如何提高植物的耐鹽性成為農(nóng)業(yè)育種人員的重要研宄課題；分離克隆耐鹽基因、培育耐鹽新品種和提高農(nóng)作物的耐鹽性能已經(jīng)成為現(xiàn)代作物育種研宄工作的關(guān)鍵技術(shù)。小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，種植面積、總產(chǎn)量及總貿(mào)易額均居糧食作物之首?？寺⌒←溎望}基因、利用轉(zhuǎn)基因改良植物技術(shù)將耐鹽基因轉(zhuǎn)入高生物量植物中，以此開發(fā)高效的轉(zhuǎn)基因小麥新品種并用于在鹽堿地種植，是一項(xiàng)具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)。
[0003]近年來(lái)，科學(xué)家們利用基因工程技術(shù)開展植物耐鹽方面研宄已取得了較大的進(jìn)展，克隆了大量相關(guān)基因，并將這些基因轉(zhuǎn)入植物中，用于耐鹽機(jī)制研宄。一些實(shí)驗(yàn)表明，將植物本身以及其它生物中與耐鹽相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入植物中，其異源轉(zhuǎn)化和翻譯產(chǎn)物可以使轉(zhuǎn)基因植物的抗鹽能力得到提高。因此，克隆小麥耐鹽基因并將其轉(zhuǎn)化和應(yīng)用，在獲得耐鹽高產(chǎn)小麥新品種的研宄中具有極其重要的意義。目前，已發(fā)現(xiàn)了一些能顯著提高植物耐鹽能力的基因，但有關(guān)NAS類基因在植物耐鹽過(guò)程中的作用尚未見報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種首次從小麥中分離出的耐鹽基因7?胤?7，將該基因連接到表達(dá)載體PCAMBIA1300上，利用農(nóng)桿菌浸染法轉(zhuǎn)入擬南芥中，獲得了生長(zhǎng)發(fā)育較好、耐鹽性能較高的轉(zhuǎn)基因擬南芥，為農(nóng)作物耐鹽新品種的研宄和培育提供了基礎(chǔ)資源。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種小麥耐鹽基因7i^VA?7，該基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，分子量大小為1120 bp;
或其cDNA的編碼序列具有如SEQ ID NO:1中第52至第1053位所述的核苷酸序列； 或其gDNA的編碼序列具有如SEQ ID NO:1中第52至第1053位所述的核苷酸序列。
[0006]本發(fā)明克隆所述基因的上游引物NASl-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示、下游引物NASl-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
[0007]本發(fā)明所述的小麥耐鹽基因位于小麥4D染色體上。
[0008]由上述的小麥耐鹽基因7^制分編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0009]本發(fā)明還同時(shí)提供了一種重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為插入了如SEQ ID No:l所示的核苷酸序列或含有SEQ ID N0.1所述序列的pCAMBIA1300載體，該重組質(zhì)粒為pCAMBIA1300-7^yVA?7。此外，任何一種可以將外源基因?qū)胫参镏斜磉_(dá)的載體都可以用于本發(fā)明，本發(fā)明優(yōu)選PCAMBIA1300作為載體。
[0010]本發(fā)明提供的小麥耐鹽基因在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。其中所述植物為普通小麥或擬南芥。本發(fā)明所述的基因可廣泛用于選育耐鹽農(nóng)作物新品種。
[0011]將本發(fā)明所述基因?qū)胫参飻M南芥細(xì)胞，植物擬南芥就可以獲得耐鹽的能力。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞系進(jìn)行篩選，可以對(duì)含有所述基因的植物表達(dá)載體PCAMBIA1300-進(jìn)行加工，如可以加入選擇標(biāo)記(⑶S等)或者具有抗性的抗生素標(biāo)記物(潮霉素、卡那霉素或慶大霉素等)等。
[0012]本發(fā)明所用科農(nóng)9204為審定品種，于2002年通過(guò)河北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定；2003年通過(guò)全國(guó)品種審定，品種審定編號(hào)為國(guó)審麥2003037。
[0013]本發(fā)明利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，首次克隆得到了小麥耐鹽基因TaNASl，共通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)過(guò)比較分析證明，該轉(zhuǎn)基因擬南芥植株具有較強(qiáng)的耐鹽能力，這為農(nóng)作物耐鹽新品種的研宄和培育提供了良好的遺傳材料。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為小麥基因的cDNA序列及gDNA序列的擴(kuò)增結(jié)果。M為DNA MarkerIII(天根生化科技有限公司，北京)。
[0015]圖2為小麥基因用中國(guó)春缺體-四體的定位結(jié)果。
[0016]圖3為轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的分子檢測(cè)結(jié)果。
[0017]圖4為鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子萌發(fā)及生長(zhǎng)圖。
[0018]圖5為鹽脅迫下轉(zhuǎn)因擬南芥株系種子發(fā)芽率狀況圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0020]實(shí)施例1克隆基因的cDNA 1、提取小麥Total RNA
(1)將科農(nóng)9204的組織材料放入液氮預(yù)冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；
(2)待液氮揮發(fā)干，立即轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中，每10mg材料約加入Iml的Invitrogen公司的Trizol提取液，融化后，用加樣槍反復(fù)吸吹，劇烈振蕩混勾樣品，使其充分裂解，室溫放置5分鐘；
(3)加入0.2ml氯仿(chloroform)，劇烈振蕩混勾15秒，室溫放置10分鐘；在4°C下，12000 rpm離心15分鐘；
(4)小心吸出上層水相，加入到干凈的1.5ml的離心管中，加入500μ I的異丙醇(上層水相與異丙醇的體積比為1:1)，充分混勻，在_20°C下，沉淀30 min ;在4°0下，12000 rpm離心10 min，小心棄去上清液，留沉淀；
(5)將沉淀用Iml的75%乙醇洗滌，在4°C下，8000 rpm離心10 min，收集RNA沉淀；
(6)用75%的乙醇洗滌一次RNA沉淀；
(7)去上清，RNA沉淀于無(wú)菌操作臺(tái)上晾干約10-15分鐘，當(dāng)RNA略顯透明，加入50μ I的RNase-free水充分溶解，可放于_80°C下長(zhǎng)期保存，備用； (8)用紫外分光光度計(jì)及質(zhì)量濃度為1%的Agrose凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度及質(zhì)量。
[0021]2、cDNA 反轉(zhuǎn)錄
按照RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0試劑盒(TaKaRa，DRRO19A)的說(shuō)明書進(jìn)行；首先進(jìn)行第一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以500 ng RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照所述說(shuō)明書指示在反應(yīng)體系中依次加入由 MgCl2、10 X RT buffer、RNase Free dH20、dNTP Mixture>RNase Inhibitor、AMVReverse Transcriptase、01igo dT Primer 和 Total RNA 組成的反應(yīng)體系共 10 μ L0 反應(yīng)程序?yàn)?42°C 30 min, 99°C 5 min, 5°C 5 min。
[0022]3、克隆和序列測(cè)定
(1)以cDNA為模板，在5’UTR和3’ UTR設(shè)計(jì)基因特異引物，引物序列分別為:
NASl-Fl:5，-GCTCTAGACTCCATCAGCCACTCTCCAC-3，(如 SEQ ID NO: 3 所示)，
NASl-Rl:5’ -CGGGATCCGCAGGCGATCAAGCAGCTAG-3’(如 SEQ ID NO: 4 所示)；
(2)PCR反應(yīng)體系(共20 yL):
2 X Taq PCR MasterMix10 μ L
Primer NASl-Fl0.5 μ L
Primer NASl-Rl0.5 μ L
Template cDNAI μ L
ddH208 μ L
(3)?0?反應(yīng)程序:94°0預(yù)變性5min;94°C變性 30 sec，58°C退火 30 sec，72°C延伸
Iminl5s，30循環(huán)/min ;72°C延伸7 min ;20°C保存，擴(kuò)增得到的特異擴(kuò)增條帶(見圖1)；
回收PCR產(chǎn)物連接pEASY-Blunt cloning vector (全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1，其分子量大小為1120 bp，其起始密碼子到終止密碼子的大小為1002 bp，該P(yáng)CR產(chǎn)物的基因命名為7^傾分，基因編碼的蛋白為TaNASl，編碼該蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0023]實(shí)施例2基因組gDNA全長(zhǎng)克隆
(I)gDNA提取:按照植物gDNA提取試劑盒說(shuō)明書(天根生化科技有限公司，北京)方法提取科農(nóng)9204小麥gDNA。
[0024](2)以科農(nóng)9204gDNA為模板，在5’ UTR和3’ UTR設(shè)計(jì)基因特異引物，
NASl-Fl5’ -GCTCTAGACTCCATCAGCCACTCTCCAC-3’ ；
NASl-Rl 5’ -CGGGATCCGCAGGCGATCAAGCAGCTAG-3’ ；
進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件同實(shí)例I擴(kuò)增cDNA的操作步驟。將得到的特異擴(kuò)增條帶(見圖1)，連接 pEASY-Blunt cloning vector 并測(cè)序，得到了 7^7^57在科農(nóng) 9204 中的全長(zhǎng) gDNA序列，序列大小為1120bp，從起始密碼子到終止密碼子大小為1002 bp。
[0025]由于實(shí)施例中cDNA的開放閱讀框大小為1002 bp，其gDNA從起始密碼子到終止密碼子的大小亦為1002 bp，可見，基因的結(jié)構(gòu)中無(wú)內(nèi)含子，其cDNA和gDNA的編碼序列相同，均如SEQ ID NO:1中第52位到第1053位共1002bp所述的核苷酸序列，自5’端的第52至54位核苷酸為起始密碼子ATG，自5’端的第1053至1055位核苷酸為終止密碼子 TGA0
[0026]實(shí)施例3基因在小麥染色體4D上的定位
(O中國(guó)春缺體-四體系gDNA提取:提取方法同實(shí)例2中步驟(I)所述。
[0027]以I μ L中國(guó)春缺體-四體系DNA作為模板，通過(guò)PCR對(duì)基因進(jìn)行染色體定位，擴(kuò)增引物和PCR條件同實(shí)例I中3的步驟(I)和(2)。
[0028]根據(jù)內(nèi)參Actin的擴(kuò)增情況作為中國(guó)春的缺體-四體系材料擴(kuò)增的陽(yáng)性對(duì)照。
[0029]引物序列為:
actin-F 5’ -GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3’，
actin-R 5’ -GAACTTCCACTGAGAACAACATTACC-3’ ；
以一套普通小麥品種中國(guó)春的缺體-四體系材料的gDNA為模板，用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)基因進(jìn)行染色體定位，結(jié)果顯示，除在缺失染色體4D的缺體-四體系中無(wú)特異條帶外，在其余缺體-四體系中均可擴(kuò)增出很亮的特異條帶，因此，
缺失染色體4D的缺體-四體系中I Kb特異擴(kuò)增該條帶缺失，從而將該基因定位于小麥4D染色體上，擴(kuò)增條帶圖譜如圖2所示。
[0030]實(shí)施例4重組質(zhì)粒pCAMBIA1300- 7^傾分的獲得
(1)用限制性內(nèi)切酶XbaI和Bam HI對(duì)由實(shí)例I得到的1120bp的PCR產(chǎn)物(7?況基因)進(jìn)行雙酶切，其雙酶切體系為Xba I Iul，BamH I Iul，1XbufferK lul，PCR產(chǎn)物5ul，ddH20 12ul)，得基因的酶切產(chǎn)物；
(2)用內(nèi)切酶XbaI和Bam HI對(duì)質(zhì)粒pCAMBIA1300雙酶切，其雙酶切體系:Xba I lul,BamH I Iul，1XbufferK lul，質(zhì)粒 5ul，ddH20 12ul，獲得 pCAMBIA1300 的酶切產(chǎn)物;
(3)分別將基因的酶切產(chǎn)物和載體用限制性內(nèi)切酶在37°C下酶切3-5h，之后65°C 20 min使限制性內(nèi)切酶失活。將目的片段基因的酶切產(chǎn)物與載體PCAMBIA1300的酶切產(chǎn)物按8:1的摩爾比，同時(shí)加入I yL T4 DNA Iigase和2 μ L 10ΧΤ4DNA ligase buffer，加水至20 μ L ;4°C過(guò)夜連接；獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1300- TaNASl,后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司，北京)，鑒定重組質(zhì)粒后即得到帶有目的基因的雙源表達(dá)載體。
[0031](4)重組質(zhì)粒的鑒定:用菌落PCR法篩選有插入片段的克隆，具體操作如下:
Α.挑取轉(zhuǎn)化后白色菌落在平板上劃短線，37°C培養(yǎng)至菌線可見時(shí)，即可進(jìn)行菌落PCR反應(yīng)。
[0032]B.用牙簽刮取少量的菌體轉(zhuǎn)入20 μ I含適當(dāng)引物的PCR體系中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系:2 X Taq PCR MasterMix 10 μ L，NASl-Fl I μ L, NASl-Rl I μ I,菌體，ddH20 8 yL，PCR反應(yīng)程序:PCR反應(yīng)程序:94 °C預(yù)變性5 min ;94°C變性30 sec，58°C退火 30 sec，72°C延伸 I minl5s，30 循環(huán) /min ;72°C延伸 7 min ;20°C保存；
C.PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)是否含有1120bp分子量大小的片段，驗(yàn)證載體為正確的構(gòu)建，鑒定重組質(zhì)粒后即得到帶有目的基因的植物表達(dá)載體。
[0033]將重組質(zhì)粒送去測(cè)序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將SEQ ID NO:1所述的自5’末端第
1-1120位核苷酸插入？041^從1300的乂6& I和BamH I酶切位點(diǎn)之間，如此得到的載體我重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1300- TaNASl。
[0034]實(shí)施例5將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)
(I)培養(yǎng)農(nóng)桿菌GV3101:挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于3 mL YEB(60 mg/L rif)液體培養(yǎng)基中，28°C搖培過(guò)夜。取500 UL接種于50 mL YEB (60 mg/L rif)液體培養(yǎng)基中，28°C搖培至0D600為0.6 ;將菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，冰浴30 min ;4°C，5000g，離心5 min ;棄上清，沉淀用10 mL 0.15 mol/L的NaCl重懸；4°C，5000g，離心5 min ;棄上清，沉淀用I mL20 mmol/L的CaCl2重懸；每管100 μ L/管分裝；液氮冷凍5 min ;_70°C保存。
[0035](2)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入:將10 μ L實(shí)施例4制備的重組質(zhì)粒pCAMBIA1300_ TaNASl加入100 4 1^農(nóng)桿菌6￥3101感受態(tài)中，混勻；依次冰浴30 min，液氮冷凍3_5 min，37°C水浴5 min ;加入I mL YEB液體培養(yǎng)基，28°C緩慢搖培2-4 h ；4°C,5000 rpm，離心5 min ;棄部分上清，剩余上清重懸菌體后涂于YEB (60 mg/L rif)固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2_3天。
[0036](3)菌體PCR鑒定，挑陽(yáng)性克隆得到重組農(nóng)桿菌，其具體鑒定步驟同實(shí)例4中步驟
(4)所述。
[0037]實(shí)施例6轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選及獲得
(1)擬南芥的種植:將野生型擬南芥種子用7.5%次氯酸鈉溶液(包括質(zhì)量濃度為7.5%的次氯酸鈉和質(zhì)量濃度為0.01%的Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無(wú)菌水漂洗5_6次，點(diǎn)播于MS平板上，于4°C春化2-3天；然后移植到營(yíng)養(yǎng)缽中(營(yíng)養(yǎng)土與蛭石的體積比為1:1)，23° C培養(yǎng)，16/8 h光周期，光強(qiáng)30-40 μ moInT2 s—1;待植株開花后，剪去其主枝頂端，促進(jìn)側(cè)枝發(fā)展；在剪枝后的4-6天內(nèi)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化；
(2)轉(zhuǎn)化:于試管中YEB液體培養(yǎng)基搖培重組農(nóng)桿菌，28°C過(guò)夜。按1:100的比例將過(guò)夜搖培的重組農(nóng)桿菌擴(kuò)培于100 mL YEB液體培養(yǎng)基中，至0D600約為1.0 ;室溫，5500g，離心10 min集菌；將菌體重懸于轉(zhuǎn)化介質(zhì)中，調(diào)0D600約為0.8 ;將含有重組農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)倒入適當(dāng)容器中，將選擇好的擬南芥倒置其上(轉(zhuǎn)化前將角果及已完全開放的花蕾剪去，僅留下剛剛露白及幼嫩的花蕾)，浸泡5 min;取出擬南芥，側(cè)臥放在干凈的塑料盆中，并用黑色薄膜覆蓋避光保濕恢復(fù)培養(yǎng)16-24小時(shí)；揭開薄膜，將擬南芥置于光下，正常培養(yǎng)；
(3)陽(yáng)性植株的篩選:!；代種子用質(zhì)量濃度為7.5%的次氯酸鈉溶液(包括7.5%的次氯酸鈉和0.01% Triton-XlOO)消毒后，點(diǎn)播在MS選擇培養(yǎng)板(25 mg/L潮霉素)上；于4°〇下春化2-3天；移入培養(yǎng)室中培養(yǎng)；培養(yǎng)10天，挑選潮霉素抗性植株(長(zhǎng)出真葉1-2對(duì)，根伸長(zhǎng)至培養(yǎng)基中)并移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中；培養(yǎng)直至種子成熟；同樣方法篩選T1代種子得到T 2代植株；并在1~2代植物中挑選抗性比為3:1的單拷貝插入獨(dú)立株系，并獲得純合T 3代株系0E1、0E2 和 0E4 ；
(4)轉(zhuǎn)7^傾分基因的擬南芥分子檢測(cè):對(duì)上述獲得的0E1、0E2和0E4進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥的分子檢測(cè)，以轉(zhuǎn)化株系的gDNA為模板，使用基因特異引物進(jìn)行基因組PCR，鑒定陽(yáng)性克隆，其擴(kuò)增引物和PCR條件同實(shí)例I中3的步驟(I)和(2);結(jié)果見圖3。
[0038](6)從圖3中陰性為哥倫比亞野生型擬南芥基因組為模板的陰性對(duì)照；0E1、0E2和0E4分別表示三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)基因株系OE1、0E2和OE 4和陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出了目標(biāo)大小條帶，而陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增出條帶。
[0039]實(shí)施例7轉(zhuǎn)化植株耐鹽性鑒定
將野生型擬南芥WT和T3代單拷貝純合擬南芥株系0E1、0E2和OE 4的種子用7.5%次氯酸鈉溶液(包括質(zhì)量濃度為7.5%的次氯酸鈉和質(zhì)量濃度為0.01%的Triton-X 100)消毒15分鐘，然后用無(wú)菌水漂洗5-6次，點(diǎn)播于含200mmol/L的NaCl的MS平板上，于4°C春化2-3天，23°C培養(yǎng)，16/8h光周期，光強(qiáng)30-40 μ moInT2 S、以同樣條件無(wú)鹽脅迫為空白對(duì)照，觀察植株生長(zhǎng)情況。植株長(zhǎng)勢(shì)情況結(jié)果見圖4。圖中4a表示空白對(duì)照種子萌發(fā)的狀況，4b表示在200 mmol/L的NaCl鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥株系0E1、0E2和0E4與野生型擬南芥(WT)，從圖中的對(duì)比可以明顯看出轉(zhuǎn)入小麥耐鹽基因的擬南芥生長(zhǎng)明顯具有很強(qiáng)的耐鹽性能。
[0040]對(duì)空白對(duì)照及鹽脅迫下野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥OE1、OE2和OE 4種子萌發(fā)率做統(tǒng)計(jì)，其萌發(fā)率以種子露出小白芽為依據(jù)，培養(yǎng)15天后統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5，從數(shù)據(jù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在含鹽培養(yǎng)基中的萌發(fā)率顯著高于野生型，表明轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽能力明顯增加。
【權(quán)利要求】
1.一種小麥耐鹽基因該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.—種小麥耐鹽基因該基因的cDNA和gDNA的編碼序列如SEQID NO:1中第52位至第1053位所述的核苷酸序列。
3.—種由權(quán)利要求1所述的小麥耐鹽基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDNO: 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥耐鹽基因7i^VA?2，其特征是，克隆所述基因的上游引物NASl-Fl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示、下游引物NASl-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥耐鹽基因化傾分，其特征是，所述基因位于小麥4D染色體上。
6.—種重組質(zhì)粒，插入了如權(quán)利要求1所述SEQID No:1的核苷酸序列或含有SEQ IDNo:1所述核苷酸序列的pCAMBIA1300載體。
7.一種小麥耐鹽基因在提高植物擬南芥耐鹽性中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104513825SQ201410819112
【公開日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】李俊明, 張瑋, 韓潔, 孫麗靜, 紀(jì)軍, 崔法 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所